進(jìn)入十月以來，不少父母反映自家孩子感染了呼吸道合胞病毒（RSV），甚至有患兒因病情嚴(yán)重被送入ICU。據(jù)某市兒童醫(yī)院透露，近期因發(fā)熱、咳嗽、哮喘等呼吸道癥狀前來急診的兒童數(shù)量，較9月底上升約30%。在呼吸科住院患兒中，呼吸道合胞病毒肺炎的檢出率居首位，其中最小的患者僅為1個(gè)多月大。為何RSV病毒對(duì)嬰幼兒威脅如此之大？
信息來源：新晚報(bào)
RSV威脅：嬰幼兒與老人的高危挑戰(zhàn)
呼吸道合胞病毒（RSV）傳染性強(qiáng)，主要經(jīng)飛沫和接觸傳播，冬季早春高發(fā)，潛伏期2–8天。嬰幼兒、老人及免疫功能低下者為高危人群，尤其6個(gè)月以下嬰兒感染易致嚴(yán)重肺炎。臨床表現(xiàn)差異大：嬰兒可表現(xiàn)為呼吸暫停、肺部啰音；成人多呈上感癥狀，老年人可能發(fā)展為氣管炎或肺炎。RSV之所以能引發(fā)如此嚴(yán)重的健康威脅，與其獨(dú)特的病毒學(xué)結(jié)構(gòu)密不可分。?
RSV病毒結(jié)構(gòu)
呼吸道合胞病毒（RSV）的基因組全長為15.2 kb（圖1），包含10個(gè)基因，共編碼11種蛋白。值得注意的是，其M2基因含有兩個(gè)重疊的開放閱讀框（ORF），可分別表達(dá)M2-1和M2-2蛋白。其中M2-1蛋白對(duì)病毒轉(zhuǎn)錄過程至關(guān)重要，而M2-2蛋白則調(diào)控病毒從轉(zhuǎn)錄階段向基因組復(fù)制階段的轉(zhuǎn)換。RSV基因組的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2，這兩種蛋白通過協(xié)同作用抑制細(xì)胞凋亡和干擾素應(yīng)答。基于該病毒的結(jié)構(gòu)特征，目前RSV的藥物以及疫苗研發(fā)也取得了很大進(jìn)展。
圖1.呼吸道合胞病毒（RSV）的基因組結(jié)構(gòu)與蛋白結(jié)構(gòu)。（A）RSV基因組結(jié)構(gòu)。
（B）RSV蛋白結(jié)構(gòu)。
RSV目前藥物研發(fā)進(jìn)展:
在過去二十年中，隨著對(duì)呼吸道合胞病毒（RSV）發(fā)病機(jī)制與免疫病理學(xué)認(rèn)識(shí)的深化，研究者在RSV的治療以及預(yù)防策略上取得了重要突破。
1) RSV的藥物治療
盡管RSV帶來的疾病負(fù)擔(dān)沉重，且特異性防治手段有限，但研究者在該領(lǐng)域已取得顯著進(jìn)展。
表1.目前已上市RSV治療藥物
2）RSV疫苗研發(fā)三大方向
在過去十年中，評(píng)估不同RSV疫苗策略的試驗(yàn)數(shù)量顯著增加。RSV擁有多種表面蛋白，其中融合(F)蛋白和吸附(G)蛋白是兩種主要的糖蛋白，也是免疫接種的關(guān)鍵靶點(diǎn)。兩者對(duì)感染性和病毒致病性都至關(guān)重要。RSV有兩個(gè)不同的亞型，RSV-A和RSV-B，主要通過G蛋白的變異來區(qū)分，而F蛋白更為保守，這使得F蛋白成為開發(fā)疫苗和單克隆抗體的優(yōu)選靶點(diǎn)。自從發(fā)現(xiàn)F蛋白有兩種構(gòu)象形式，即"融合前F"（pre-F）和"融合后F"（post-F），并了解到融合前構(gòu)象可誘導(dǎo)更高效力的中和抗體后，pre-F已成為RSV特異性干預(yù)措施的首選靶點(diǎn)。
圖2.多種單克隆抗體靶向的融合前F蛋白抗原位點(diǎn)
當(dāng)前的RSV候選疫苗研發(fā)布局主要集中在以下三大方向：
基于重組載體的疫苗：使用經(jīng)過修飾的復(fù)制缺陷型病毒，通過遞送相關(guān)RSV蛋白（抗原）的基因來誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。目前有三種基于重組載體的候選疫苗處于臨床試驗(yàn)階段（2-3期）。
核酸疫苗：作用機(jī)制是基于將編碼RSV抗原的信使RNA（mRNA）引入細(xì)胞。近年來，mRNA疫苗在對(duì)抗SARS-CoV-2感染方面顯示出安全性和高效力，突出了這種方法的潛力。雖然該類型疫苗仍在開發(fā)中，只有一項(xiàng)用于成人的RSV mRNA疫苗的1期試驗(yàn)已經(jīng)發(fā)表，但其從SARS-CoV-2疫苗中獲得的經(jīng)驗(yàn)，后續(xù)可能會(huì)進(jìn)行更多試驗(yàn)。
基于蛋白的疫苗（包括全病毒滅活疫苗、顆粒疫苗和亞單位疫苗）：免疫機(jī)制是基于以更高密度的展示各種抗原以產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。目前的候選疫苗是為老年人或通過母體疫苗接種保護(hù)嬰兒而設(shè)計(jì)的。
目前RSV防治面臨雙重挑戰(zhàn)：治療端因病毒損傷窗口期短，藥物難以生效；預(yù)防端受歷史疫苗失敗案例制約，需精準(zhǔn)靶向F蛋白前融合構(gòu)象。未來核心突破在于策略轉(zhuǎn)型——從抗病毒轉(zhuǎn)向早期暴露預(yù)防及免疫調(diào)節(jié)，并依托長效單抗（如Nirsevimab）、母體疫苗等創(chuàng)新技術(shù)實(shí)現(xiàn)全年齡段防護(hù)。
迪福潤絲生物RSV中和抗體檢測(cè)服務(wù)
迪福潤絲生物自有的CRO服務(wù)平臺(tái)「DIFF+」可針對(duì)RSV疫苗效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，提供基于熒光斑點(diǎn)計(jì)數(shù)法的RSV中和抗體檢測(cè)服務(wù)，該檢測(cè)方法能夠與傳統(tǒng)的PRNT檢測(cè)方法建立線性相關(guān)性，靈敏度高、檢測(cè)迅速，并且該實(shí)驗(yàn)方法的特異性、重復(fù)性均能滿足中和實(shí)驗(yàn)的要求，適用于高通量樣本的檢測(cè)。
圖3.RSV中和抗體檢測(cè)流程圖
熒光斑點(diǎn)計(jì)數(shù)法
測(cè)定RSV（呼吸道合胞病毒）中和抗體的方法有多種，其中熒光斑點(diǎn)計(jì)數(shù)法（Focus-Forming Assay, FFA）相對(duì)于傳統(tǒng)的細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathic Effect, CPE）法和其他方法具有以下明顯優(yōu)勢(shì)：靈敏度和特異性高、快速結(jié)果、定量準(zhǔn)確、自動(dòng)化和高通量、適用性廣泛。
表2.熒光斑點(diǎn)計(jì)數(shù)法具有明顯優(yōu)勢(shì)
熒光斑點(diǎn)計(jì)數(shù)法在RSV中和抗體檢測(cè)中展現(xiàn)出高靈敏度和特異性，可實(shí)現(xiàn)快速定量分析，并易于自動(dòng)化和高通量篩查。相較于傳統(tǒng)CPE等方法，其在快速性、準(zhǔn)確性和效率方面有著顯著優(yōu)勢(shì)，使其成為科研與實(shí)踐中優(yōu)先選用的可靠檢測(cè)方案。
毒株資源列表：
服務(wù)內(nèi)容：
RSV中和抗體檢測(cè)服務(wù)案例
基于以上檢測(cè)流程，迪福潤絲生物可進(jìn)行RSV疫苗中和抗體檢測(cè)及抗病毒藥物篩選等服務(wù)。將待測(cè)樣本與RSV病毒共孵育后加入待感染細(xì)胞，CC孔為細(xì)胞對(duì)照，不加病毒，VC孔為病毒對(duì)照，只加病毒，檢測(cè)結(jié)果如圖所示。
根據(jù)熒光斑點(diǎn)計(jì)數(shù)儀的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)結(jié)果，半中和滴度NT50使用GraphPad Prism軟件中的非線性回歸分析計(jì)算值，檢測(cè)樣本1的NT50值為0.02133μg/ml，檢測(cè)樣本2的NT50值為0.0199μg/ml。
面對(duì)RSV防治挑戰(zhàn)，迪福潤絲「DIFF+」平臺(tái)為您提供高效可靠的RSV中和抗體檢測(cè)解決方案。平臺(tái)采用熒光斑點(diǎn)計(jì)數(shù)法，兼具高靈敏度與高特異性，能夠實(shí)現(xiàn)快速、精準(zhǔn)的定量分析。
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