期刊： Scientific Reports
影響因子：3.9
主要技術：scRNAseq ，BD AbSeq，qPCR
導語
單核吞噬細胞(MNP)，包括巨噬細胞和樹突狀細胞，構成了對環境危害和毒性暴露初級反應的重要組成部分。這在哮喘和過敏性氣道疾病等疾病條件下尤為重要，因為這些疾病中存在許多不同的細胞類型。在本研究中，我們將CD34+造血干細胞向不同的MNP群體分化，以了解炎癥疾病微環境中存在的不同細胞亞型如何對常見過敏原屋塵螨(HDM)作出反應。
研究技術
scRNAseq ，BD AbSeq，qPCR
研究方法
細胞模型：使用人原代骨髓來源的CD34+造血干細胞，通過兩種不同方案分化為：
巨噬細胞樣細胞(MLC)：使用CSF1、CSF2和TGFβ
樹突狀細胞樣細胞(DLC)：使用FLT3L、CSF2和IL-4
暴露處理：
HDM(屋塵螨)：25μg/ml
DEP(柴油尾氣顆粒)：25μg/ml
聯合暴露：HDM+DEP
實驗結果
1. CD34 +造血干細胞培養及髓系分化
為了建立一組人原代髓系細胞，通常在過敏性和非過敏性哮喘條件下發現，我們使用兩種方案將CD34 +造血干細胞分化為巨噬細胞樣( MLC )或樹突狀樣細胞( DLC ) (圖1A )。在形態學上，經過21天的培養，兩種細胞群均含有貼壁細胞和非貼壁細胞，表明培養物中存在不同表型的細胞(圖1B )。通過全轉錄組mRNA的單細胞測序，結合寡核苷酸標記的抗體檢測細胞表面蛋白(圖1C - F)的表達，對這些細胞進行進一步的鑒定。將兩種方案中的細胞合并進行分析，每種方案中的細胞類型根據UMAP分離鑒定。
圖 1
2. 巨噬細胞亞群對塵螨暴露表現出不同的反應
使用MLC培養方案對髓系細胞亞群進行培養，并檢測其對單劑量HDM作用24 h的反應。細胞形態(圖2A )和毒性(附圖S4)無明顯變化。檢測這些培養物對HDM反應的整體轉錄變化，發現主要炎癥基因如CXCL5和MT1G的變化(圖2B )。我們還進行了Scseq分析，以確定巨噬細胞樣細胞群(圖2C - F)中基因表達的細胞類型特異性變化。對所有細胞的Scseq數據進行差異表達分析，也鑒定出與bulk - seq分析類似的炎癥基因表達變化(圖2C )。為了檢查基因表達的細胞類型特異性變化，使用Seurat KNN分析對Scseq數據進行聚類，使用高度分散的基因(用HDM去除差異調節基因)作為輸入。結果以UMAP圖顯示，每個點代表一個單元格(圖2D , E)。這導致了處理在細胞群體中的均勻分布(圖2D )。聚類分析(圖2E )鑒定出6個主要細胞群體，與圖1中鑒定出的亞群體有較近的對應關系。
圖 2
3.柴油車尾氣顆粒物暴露改變了巨噬細胞樣細胞中的塵螨反應，部分是通過Nrf2信號驅動的
接下來，我們研究了不同類型的環境吸入危害，DEP如何單獨或與HDM暴露結合影響MLC方案分化的細胞。在處理24 h后，DEP單獨或與HDM聯合誘導了類似的LDH釋放增加，表明這些顆粒(附圖S4)具有一定的細胞毒性作用。相比之下，HDM并沒有顯著改變這種反應。細胞對DEP反應的形態學評估顯示細胞攝取顆粒，當與HDM聯合使用時沒有明顯差異(圖3A )，DEP粒徑分布無明顯差異。與單獨的HDM相比，表達方式和CCL15引起了顯著的降低(圖3C )。接下來我們檢測了去除DEP表面上發現的化學物質對基因e表達方式的影響。與未清洗的DEP相比，用清洗的DEP顆粒( DEP.C )處理可完全降低CYP1B1 e表達方式(圖3C )。SLC7A11和NQO1的減少在單獨使用清潔顆粒和與HDM ( H + D.C)聯合處理時也被觀察到。
圖 3
4. 去除DEP表面的化學物質對基因表達的影響。
在這些處理中觀察到的Nrf2依賴性基因表達的變化，使我們進一步使用Nrf2抑制劑ML385來檢查這一途徑。該小分子與Nrf2的Neh1區域結合，干擾與DNA結合序列結合的蛋白復合物30。MLC方案分化的細胞暴露于HDM & DEP單獨或與ML385聯合4小時(圖4 )，并使用bulk - seq分析檢查全局基因表達變化。H + D處理導致大量差異表達基因，其中上調基因多于下調基因(圖4A )。大多數上調的基因包括參與炎癥過程的基因，包括CXCL5，CXCL8，IL1B和IL19 (圖4A )。與ML385共處理導致H + D誘導基因的抑制，包括IL19，CXCL5和CXCL8 (圖4B )。通過對不同處理的標準化計數值( RPKM )的可視化來進一步詢問選擇基因(圖4C )。這表明ML385在10 μ M劑量下降低Nrf2依賴的基因表達最顯著，表明該通路存在功能性抑制。H + D誘導的炎癥趨化因子CXCL5，CXCL8和CCL5的表達也被ML385抑制，最后，我們研究了在DLC方案中分化的樹突狀樣細胞在HDM和DEP處理后是否表現出抗原呈遞途徑的變化。我們著重以CD40和HLA - DRA的表達變化作為抗原呈遞功能的代表性指標。
圖 4
總結
通過單細胞測序，我們證明巨噬細胞亞型MCSPP1+和MLCMARCO+在HDM刺激后顯示出不同的基因表達模式，特別是趨化因子CXCL5、CXCL8、CCL5和CCL15。MLCCD206Hi(替代激活的巨噬細胞)顯示出最大的表達變化，而中性粒細胞和單核細胞群體沒有反應。進一步的工作研究了污染物柴油機尾氣顆粒(DEP)如何改變這些轉錄反應，并發現CXC型而非CC型趨化因子被進一步上調。通過使用去除吸附材料的柴油顆粒，我們表明這些顆粒上的可溶性污染物是導致HDM效應改變的有效成分。這項研究強調，環境暴露可能影響組織反應，這取決于存在的MNP細胞類型，在體外模擬這些事件時應考慮這些因素。了解不同免疫細胞類型對過敏原和污染物暴露的細微反應，也有助于更好地理解這些暴露如何影響人類疾病的發展和惡化。
討論與展望
局限性：體外模型不能完全模擬體內復雜的細胞互作和微環境。
未來方向：1.結合空間轉錄組學分析細胞定位與功能關系2.探索靶向特定MNP亞型治療過敏性疾病的潛力3.研究其他環境污染物與過敏原的交互作用
參考文獻：
Fransen LFH, Leonard MO. Mononuclear phagocyte sub-types in vitro display diverse transcriptional responses to dust mite exposure. Sci Rep. 2024 Jun 20;14(1):14187. doi: 10.1038/s41598-024-64783-1. PMID: 38902328; PMCID: PMC11189906.