期刊： Scientific Reports
影響因子：3.9
主要技術(shù)：scRNAseq ，BD AbSeq，qPCR
導(dǎo)語
單核吞噬細(xì)胞(MNP)，包括巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，構(gòu)成了對環(huán)境危害和毒性暴露初級反應(yīng)的重要組成部分。這在哮喘和過敏性氣道疾病等疾病條件下尤為重要，因?yàn)檫@些疾病中存在許多不同的細(xì)胞類型。在本研究中，我們將CD34+造血干細(xì)胞向不同的MNP群體分化，以了解炎癥疾病微環(huán)境中存在的不同細(xì)胞亞型如何對常見過敏原屋塵螨(HDM)作出反應(yīng)。
研究技術(shù)
scRNAseq ，BD AbSeq，qPCR
研究方法
細(xì)胞模型：使用人原代骨髓來源的CD34+造血干細(xì)胞，通過兩種不同方案分化為：
巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞(MLC)：使用CSF1、CSF2和TGFβ
樹突狀細(xì)胞樣細(xì)胞(DLC)：使用FLT3L、CSF2和IL-4
暴露處理：
HDM(屋塵螨)：25μg/ml
DEP(柴油尾氣顆粒)：25μg/ml
聯(lián)合暴露：HDM+DEP
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. CD34 +造血干細(xì)胞培養(yǎng)及髓系分化
為了建立一組人原代髓系細(xì)胞，通常在過敏性和非過敏性哮喘條件下發(fā)現(xiàn)，我們使用兩種方案將CD34 +造血干細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞樣( MLC )或樹突狀樣細(xì)胞( DLC ) (圖1A )。在形態(tài)學(xué)上，經(jīng)過21天的培養(yǎng)，兩種細(xì)胞群均含有貼壁細(xì)胞和非貼壁細(xì)胞，表明培養(yǎng)物中存在不同表型的細(xì)胞(圖1B )。通過全轉(zhuǎn)錄組mRNA的單細(xì)胞測序，結(jié)合寡核苷酸標(biāo)記的抗體檢測細(xì)胞表面蛋白(圖1C - F)的表達(dá)，對這些細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。將兩種方案中的細(xì)胞合并進(jìn)行分析，每種方案中的細(xì)胞類型根據(jù)UMAP分離鑒定。
圖 1
2. 巨噬細(xì)胞亞群對塵螨暴露表現(xiàn)出不同的反應(yīng)
使用MLC培養(yǎng)方案對髓系細(xì)胞亞群進(jìn)行培養(yǎng)，并檢測其對單劑量HDM作用24 h的反應(yīng)。細(xì)胞形態(tài)(圖2A )和毒性(附圖S4)無明顯變化。檢測這些培養(yǎng)物對HDM反應(yīng)的整體轉(zhuǎn)錄變化，發(fā)現(xiàn)主要炎癥基因如CXCL5和MT1G的變化(圖2B )。我們還進(jìn)行了Scseq分析，以確定巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞群(圖2C - F)中基因表達(dá)的細(xì)胞類型特異性變化。對所有細(xì)胞的Scseq數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，也鑒定出與bulk - seq分析類似的炎癥基因表達(dá)變化(圖2C )。為了檢查基因表達(dá)的細(xì)胞類型特異性變化，使用Seurat KNN分析對Scseq數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，使用高度分散的基因(用HDM去除差異調(diào)節(jié)基因)作為輸入。結(jié)果以UMAP圖顯示，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)單元格(圖2D , E)。這導(dǎo)致了處理在細(xì)胞群體中的均勻分布(圖2D )。聚類分析(圖2E )鑒定出6個(gè)主要細(xì)胞群體，與圖1中鑒定出的亞群體有較近的對應(yīng)關(guān)系。
圖 2
3.柴油車尾氣顆粒物暴露改變了巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞中的塵螨反應(yīng)，部分是通過Nrf2信號驅(qū)動的
接下來，我們研究了不同類型的環(huán)境吸入危害，DEP如何單獨(dú)或與HDM暴露結(jié)合影響MLC方案分化的細(xì)胞。在處理24 h后，DEP單獨(dú)或與HDM聯(lián)合誘導(dǎo)了類似的LDH釋放增加，表明這些顆粒(附圖S4)具有一定的細(xì)胞毒性作用。相比之下，HDM并沒有顯著改變這種反應(yīng)。細(xì)胞對DEP反應(yīng)的形態(tài)學(xué)評估顯示細(xì)胞攝取顆粒，當(dāng)與HDM聯(lián)合使用時(shí)沒有明顯差異(圖3A )，DEP粒徑分布無明顯差異。與單獨(dú)的HDM相比，表達(dá)方式和CCL15引起了顯著的降低(圖3C )。接下來我們檢測了去除DEP表面上發(fā)現(xiàn)的化學(xué)物質(zhì)對基因e表達(dá)方式的影響。與未清洗的DEP相比，用清洗的DEP顆粒( DEP.C )處理可完全降低CYP1B1 e表達(dá)方式(圖3C )。SLC7A11和NQO1的減少在單獨(dú)使用清潔顆粒和與HDM ( H + D.C)聯(lián)合處理時(shí)也被觀察到。
圖 3
4. 去除DEP表面的化學(xué)物質(zhì)對基因表達(dá)的影響。
在這些處理中觀察到的Nrf2依賴性基因表達(dá)的變化，使我們進(jìn)一步使用Nrf2抑制劑ML385來檢查這一途徑。該小分子與Nrf2的Neh1區(qū)域結(jié)合，干擾與DNA結(jié)合序列結(jié)合的蛋白復(fù)合物30。MLC方案分化的細(xì)胞暴露于HDM & DEP單獨(dú)或與ML385聯(lián)合4小時(shí)(圖4 )，并使用bulk - seq分析檢查全局基因表達(dá)變化。H + D處理導(dǎo)致大量差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因多于下調(diào)基因(圖4A )。大多數(shù)上調(diào)的基因包括參與炎癥過程的基因，包括CXCL5，CXCL8，IL1B和IL19 (圖4A )。與ML385共處理導(dǎo)致H + D誘導(dǎo)基因的抑制，包括IL19，CXCL5和CXCL8 (圖4B )。通過對不同處理的標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)數(shù)值( RPKM )的可視化來進(jìn)一步詢問選擇基因(圖4C )。這表明ML385在10 μ M劑量下降低Nrf2依賴的基因表達(dá)最顯著，表明該通路存在功能性抑制。H + D誘導(dǎo)的炎癥趨化因子CXCL5，CXCL8和CCL5的表達(dá)也被ML385抑制，最后，我們研究了在DLC方案中分化的樹突狀樣細(xì)胞在HDM和DEP處理后是否表現(xiàn)出抗原呈遞途徑的變化。我們著重以CD40和HLA - DRA的表達(dá)變化作為抗原呈遞功能的代表性指標(biāo)。
圖 4
總結(jié)
通過單細(xì)胞測序，我們證明巨噬細(xì)胞亞型MCSPP1+和MLCMARCO+在HDM刺激后顯示出不同的基因表達(dá)模式，特別是趨化因子CXCL5、CXCL8、CCL5和CCL15。MLCCD206Hi(替代激活的巨噬細(xì)胞)顯示出最大的表達(dá)變化，而中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞群體沒有反應(yīng)。進(jìn)一步的工作研究了污染物柴油機(jī)尾氣顆粒(DEP)如何改變這些轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)CXC型而非CC型趨化因子被進(jìn)一步上調(diào)。通過使用去除吸附材料的柴油顆粒，我們表明這些顆粒上的可溶性污染物是導(dǎo)致HDM效應(yīng)改變的有效成分。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)，環(huán)境暴露可能影響組織反應(yīng)，這取決于存在的MNP細(xì)胞類型，在體外模擬這些事件時(shí)應(yīng)考慮這些因素。了解不同免疫細(xì)胞類型對過敏原和污染物暴露的細(xì)微反應(yīng)，也有助于更好地理解這些暴露如何影響人類疾病的發(fā)展和惡化。
討論與展望
局限性：體外模型不能完全模擬體內(nèi)復(fù)雜的細(xì)胞互作和微環(huán)境。
未來方向：1.結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析細(xì)胞定位與功能關(guān)系2.探索靶向特定MNP亞型治療過敏性疾病的潛力3.研究其他環(huán)境污染物與過敏原的交互作用
參考文獻(xiàn)：
Fransen LFH, Leonard MO. Mononuclear phagocyte sub-types in vitro display diverse transcriptional responses to dust mite exposure. Sci Rep. 2024 Jun 20;14(1):14187. doi: 10.1038/s41598-024-64783-1. PMID: 38902328; PMCID: PMC11189906.