目前Monocle是scRNA-seq擬時序分析的經典工具，使用最廣泛的是Monocle2。Monocle2 通過反向圖嵌入(Reversed Graph Embedding) 技巧學習細胞軌跡的主要結構，然后對細胞進行排序，能較為準確地解釋復雜的生物學過程。

接下來，讓我們一起來看看運用monocle2的擬時序分析在文獻中的運用吧！

案例分析

案例一

研究概況
胰腺導管癌（PDAC）是最常見的胰腺癌，具有高度腫瘤內異質性和不良預后特征。為了全面描述PDAC的腫瘤內異質性和PDAC進展的潛在機制，協和醫院的研究人員采用單細胞測序技術獲得了來自原發性PDAC腫瘤和對照組胰腺的57,530個胰腺細胞的轉錄組圖譜，并確定了不同的惡性細胞和基質細胞類型，包括分別具有異常和惡性的基因表達譜的兩種導管亞型。作者發現異質的惡性亞型由幾個具有不同的增殖和遷移潛力的亞群組成。

樣本信息
實驗組：24個PDAC腫瘤樣本（41,986個細胞）
對照組：11個未經處理的胰腺樣本（15,544個細胞）

研究過程及結果（著重解讀擬時序分析）
為了探索腫瘤的細胞組成，作者進行了分群并在t-SNE降維結果上進行展示，確定了10個主要細胞群，包括1型導管細胞（type 1 ductal），2型導管細胞（type 2 ductal），腺泡細胞（acinar），內分泌細胞（endocrine），內皮細胞（endothelial），成纖維細胞（fibroblast），星狀細胞（stellate），巨噬細胞（macrophage），T細胞和B細胞 （T and B cells）（圖1a）

作者接下來檢測了兩種導管細胞的基因表達模式，MUC1標志物可以用來區分具有異常基因表達譜的1型導管細胞和惡化程度較高的2型導管細胞，其中1型導管細胞分為兩個不同的亞組 (圖1b)，第一個亞組顯示出較低的MUC1表達，第二個亞組顯示出較高的MUC1表達（表現出一些2型惡性導管細胞的特征）（圖1c）。

圖1.細胞分群

(a) t-SNE圖揭示PDAC中的主要細胞類型
(b) t-SNE展示1型導管細胞的2個亞組
(c) 小提琴圖展示正常導管細胞的標記物（AMBP）和腫瘤導管細胞的標記物（MUC1）在兩個亞組中的表達水平

作者對基因表達圖譜異常的1型導管細胞和惡性化程度較高的2型導管細胞進行了擬時序分析。圖2a揭示了低表達MUC1的1型導管細胞經過高表達MUC1的1型導管細胞的過渡發展為惡性化程度較高的2型導管細胞。沿著PDAC進展的軌跡，作者進一步分析了所有基因的表達模式。作者將這些基因聚類為4個異常表達模式和4個惡性模式。大部分負責細胞增殖和遷移的基因在腫瘤進展的晚期被明顯激活（圖2b）。作者同樣檢測到了多個參與PDACs腫瘤發生的關鍵調控因子和轉錄因子的激活，包括幾個可能與PDAC進展相關的基因，如PI3K-Akt通路激活劑YWHAZ（圖2c）。也就是說，細胞軌跡的分析揭示了多種腫瘤相關的通路和轉錄因子在PDAC的進展過程中差異性地表達

圖2.惡性腫瘤發展過程中的差異基因表達譜

(a) 由Monocle2推斷的有異常基因表達譜的導管細胞和惡性導管細胞的偽時間。每個點對應一個細胞。不同顏色代表不同細胞類型；
(b) 隨著偽時間差異表達的基因被分層聚類為八個模式，每個剖面的代表性基因功能和通路如圖所示；
(c) 熱圖展示了參與PDAC進展的代表性基因的表達。從藍色到紅色表示從低到高的相對表達水平；
(d) 熱圖展示了編碼參與PDACs腫瘤發生的關鍵調控因子和轉錄因子的基因的表達。從藍色到紅色表示從低到高的相對表達水平。

案例二

研究概況
為了研究免疫細胞對骨髓基質細胞和骨骼穩態的調控，華西醫院的研究人員對小鼠下顎牙槽骨樣本進行了scRNA-seq，揭示了巨噬細胞是與顱面骨髓間充質干細胞（MSCs）相互作用的最大細胞群。與長骨骨髓（LBM）相比，活化的巨噬細胞亞群在肺泡骨髓（ABM）中的比例更高，并且這個亞群是分泌細胞因子Oncostatin M（Osm）的主要群體。ABM巨噬細胞調理的培養基能通過依賴細胞因子Osm的通路更有效地促進成骨分化和抑制MSCs的成脂分化。

樣本信息
8只12周大的雄性C57BL/6J野生型小鼠下顎牙槽骨樣本

研究過程及結果 （著重解讀擬時序分析）
通過單細胞測序獲得了總共10224個細胞。根據典型的細胞表面標記，作者確定了12個細胞群，包括中性粒細胞（neutrophil），髓系祖細胞（myeloid progenitor），巨噬細胞（macrophage），樹突狀細胞（dendritic cell）, B細胞（B cell），原B細胞（pro-B cell），T細胞（T cell）, 自然殺傷細胞（natural killer cell），巨核細胞（megakaryocyte），紅細胞（erythrocyte），造血干細胞和祖細胞（hematopoietic stem and progenitor cell/HSPC），間質細胞（mesenchymal cell）（圖3）。

圖3.用UMAP對scRNA-seq鑒定的細胞進行的可視化。不同的細胞群被定義并以顏色區分。每個點代表一個獨立的細胞。

接下來，作者用CellPhoneDB2進行了細胞通訊分析，發現巨噬細胞和骨髓間充質干細胞之間存在著密切的互動。通過進一步探索巨噬細胞的異質性，巨噬細胞群被分為四個亞群 （圖4a）。其中亞群0和1普遍的標志物基因有Csf1r, Cd68和 Cd14。亞群1高表達極化巨噬細胞的標志物基因，如Stat1, Il1b和 Ccr2。亞群2高表達交替活化巨噬細胞的標志物基因Adgre1, Mrc1 and Cd209f（圖4b）。通過GO富集分析，發現亞群3的生物功能富集在細胞分裂，DNA復制和細胞增殖相關的通路，是巨噬細胞主要的增殖群體。亞群0，1，2是具有不同功能的成熟的巨噬細胞群體。亞群0富集于吞噬功能和抗原呈現，亞群1與細胞因子的分泌，細菌和細胞內病原體的免疫反應有關，亞群2表現交替活化巨噬細胞的特征如傷口愈合和血管形成的調節（圖4c）。

圖4.巨噬細胞亞分群情況

（a）巨噬細胞的四個亞群可視化
（b）巨噬細胞群中經典巨噬細胞極化標志物的表達情況
（c）巨噬細胞不同亞群的生物功能GO富集分析

接下來，作者進行了擬時序分析。基于巨噬細胞的基因表達動態，作者構建了一棵偽時間發育樹，并確定了兩個獨立的分支點 （圖5a）。這4個巨噬細胞亞群散布在發育樹的不同分支處。亞群3位于發育樹的起點，表明是其他亞群的發育起源。這一觀察結果與之前GO富集的結果（亞群3作為一個增殖群體）一致。亞群0和1位于兩個不同的分支，亞群2分布更為廣泛，部分與亞群0和1重疊（圖5b）。隨偽時間分布的基因表達模式表明Cd68和Csf1r（普遍的標志物基因）的表達曲線相對平穩。伴隨著Cd68和Csf1r （亞群0和1的maker gene）表達量的減少，Apoe和Adgre1 （亞群2的marker gene）表達量增加。Mki67和Pcna的表達只在亞群3中上調（圖5c）。如圖5d所示，在兩個分支中具有最顯著變化的且表達模式相似的基因被聚到了一類。

圖5.巨噬細胞群的擬時序分析

(a) 按偽時間值排列的巨噬細胞群的軌跡順序。每個點對應一個細胞，顏色越深表示偽時間值（離根節點的距離）越小；
(b) 巨噬細胞亞群在發育樹上的集群分布。不同顏色代表不同細胞亞群；
(c) 巨噬細胞不同亞群的標志物基因隨偽時間的表達；
(d) 兩個軌跡分支點上的差異基因的聚類熱圖。（橫坐標為偽時間，中間的白色豎條代表時間最早的細胞，豎條左右兩邊分別代表兩個Lineage上的時間點，熱圖的最左邊和最右邊分別代表這兩個Lineage上時間最晚的細胞，上方紅色、灰色、藍色的色條分別表示第一條 Lineage 特有的時間部分，兩條 Lineage 共有的時間部分，即兩條Lineage共同的祖先細胞，第二條Lineage特有的時間部分。縱坐標為基因，熱圖中的每一格表示該基因在該偽時間點的平均表達量scale后的值，顏色越藍，表達量越低，顏色越紅，表達量越高，左邊的樹為基因的層次聚類樹，不同色條表示該基因在層次聚類方法的劃分下所屬的 cluster）。

結 語

通過以上兩個案例，我們可以發現擬時序分析可以幫助了解細胞發育的軌跡以及過渡細胞類型，也可以展示在發育或分化節點起關鍵作用的核心基因在細胞進展過程中的表達情況，這些都為后續的分析奠定了一定的基礎。希望這次分享的運用monocle2進行擬時序分析的文獻能為老師們提供一些啟發。

【參考文獻】
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2.Lin, W., Li, Q., Zhang, D., Zhang, X., Qi, X., Wang, Q., Chen, Y., Liu, C., Li, H., Zhang, S., Wang, Y., Shao, B., Zhang, L., & Yuan, Q. (2021). Mapping the immune microenvironment for mandibular alveolar bone homeostasis at single-cell resolution. Bone research, 9(1), 17. https://doi.org/10.1038/s41413-021-00141-5