腺病毒感染細胞的原理是通過纖突蛋白和細胞表面CAR結合。腺病毒黏附之后，五鄰體蛋白上的精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸與細胞表面的整合素αvβ3和αvβ5結合并相互作用使腺病毒進入細胞。Ad5腺病毒的高效感染依賴于細胞膜上的CAR和αvβ整合素，但是有些免疫細胞的細胞膜上缺乏這些受體，通過研究發(fā)現(xiàn)F35血清型對造血干細胞有很強的靶向性，因此，嵌合型Ad5/F35由此產生。
對于Ad5/F35的感染效率，可以參考下面這些文獻中Ad5/F35的具體感染效果。
轉導 Ad5F35-eGFP 24 小時后骨髓間充質干細胞的轉染效果圖[1]
SMMC-7721 細胞感染了 Ad5-EGFP 或 Ad5/F35-EGFP 的效果圖[2]
EBV-LCL 細胞中 Ad5 和 Ad5/F35 感染性的比較[3]
基于此，吉凱基因開發(fā)了一種嵌合型的腺病毒Ad5/F35，對于造血干細胞的靶向性大大增強。對于改造的原理方面，我們需要先了解一下腺病毒Ad5的結構：腺病毒是一種雙鏈線性的DNA病毒，其基因組長度約36kb?；蚪M兩端各有一個103bp的反向重復序列（ITR）,參與病毒DNA的復制；Adv是一種無包膜的DNA病毒，其復制不依賴于宿主細胞的分裂，有50余種血清型，大多數(shù)腺病毒載體基于血清型2和血清型5，通過轉基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的復制能力。下面是人類血清型5型腺病毒基因組的示意圖：
人腺病毒血清型5的轉錄圖譜[4]
嵌合型的腺病毒Ad5/F35，在Ad5的基礎上，其受體結合位置的纖突改造成了F35型的纖突，下圖是Ad5/F35的結構圖。
Ad5和 Ad5/F35 的結構圖[5]
下圖是我們根據(jù)不同的文獻[6-9]，總結的對于不同的細胞Ad5/F35的MOI的推薦值。因為不同的細胞和以及實際操作的不同，建議各位老師根據(jù)推薦的MOI做相關預實驗確定實際感染的MOI。
下面根據(jù)一篇文獻Chimeric Ad5.F35 vector evades anti-adenovirus serotype 5 neutralization opposing GUCY2C-targeted antitumor immunity[10]，我們可以了解一下嵌合腺病毒載體 （Ad5/F35） 誘導對腫瘤相關抗原鳥苷酸環(huán)化酶 C （GUCY2C） 的免疫反應的能力。
Ad5介導基因轉移和誘導有效免疫反應的能力使其成為針對癌癥和傳染病的實驗性疫苗的流行載體。由于 Ad5 感染在許多人群中流行，因此全球 >70% 的人口中預先存在的 NAb 限制了基于 Ad5 的疫苗策略。這些考慮凸顯了改進載體的必要性，所以研究人員試圖通過用罕見的腺病毒血清型 Ad35替換 Ad5 纖毛來克服預先存在的 Ad5 NAbs，以提高表達胃腸道 （GI） 癌癥抗原鳥苷酸環(huán)化酶 C （GUCY2C） 的小鼠模型中的抗腫瘤免疫力。該試驗表明，人源化版本的疫苗（Ad5-GUCY2C-PADRE）在常規(guī)治療后安全地誘導了結直腸癌患者的GUCY2C特異性CD8 T細胞反應。然而，在接種 Ad5-GUCY2C-PADRE 疫苗后，具有高 NAb 對 Ad5 的預先存在的滴度的患者未能產生 GUCY2C 特異性免疫。為了克服 Ad5 NAbs，研究人員生成了一種嵌合 Ad5 載體，該載體具有 Ad35 纖毛 （Ad5/F35），在小鼠和人類中具有與 Ad5 相當?shù)陌踩院涂鼓[瘤活性以及對 Ad5 NAbs 的抗性。這種嵌合疫苗可以轉化為胃腸道癌癥患者，不僅可以在Ad5免疫力低的患者中，而且在已有的Ad5 NAbs高的患者中安全地誘導GUCY2C特異性免疫。
Ad5.F35-GUCY2C-S1的構建和抗原表達
先前的研究表明，Ad5-GUCY2C疫苗在轉移性結直腸癌小鼠模型中誘導了保護性抗腫瘤CD8 T細胞反應。因此，用表達GUCY2C-S1的Ad5或Ad5.F35對BALB/c小鼠進行免疫，并在7天后用表達GUCY2C和螢火蟲熒光素酶的CT26結直腸癌細胞進行攻擊。如前所述，Ad5疫苗接種幾乎消除了轉移性腫瘤負荷，延緩了疾病進展，并提高了生存率。同樣，Ad5.F35也降低了腫瘤負荷、疾病進展和延長生存期。重要的是，基于Ad5和基于Ad5/F35的GUCY2C疫苗在減輕腫瘤負荷、防止疾病進展和促進生存方面的功效相同。
Ad5-GUCY2C-S1 和 Ad5.F35-GUCY2C-S1 的抗腫瘤功效
參考文獻…
1.Pablo Bosch, Scott L. Pratt, et al., Isolation, Characterization, Gene Modification, and Nuclear Reprogramming of Porcine Mesenchymal Stem Cells. Biol Reprod,2005. 74(1):46-57.
2.Yanping Cun, et al., Combined use of adenoviral vector Ad5/F35-mediated APE1 siRNA enhances the therapeutic efficacy of adenoviral-mediated p53 gene transfer in hepatoma cells in vitro and in vivo., Oncol Rep. 2013 Jun;29(6):2197-204.
3. Eric S Yvon, Stephane Vigouroux., Overexpression of the Notch ligand, Jagged-1, induces alloantigen-specific human regulatory T cells., Blood. 2003 Nov 15;102(10):3815-21.
4. Vetrini, F. and P. Ng, Gene Therapy with Helper-Dependent Adenoviral Vectors: Current Advances and Future Perspectives. Viruses, 2010. 2(9): p. 1886-1917.
5. Yang, M., et al., A novel fiber chimeric conditionally replicative adenovirus-Ad5/F35 for tumor therapy. Cancer Biology & Therapy, 2017. 18(11): p. 833-840.
6. Kai Wabg, Jian-Qinag Peng, et al., Transfection efficiency of adenoviral vector AD5/F35 to malignant hematopoietic cells of different origins. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2006 Jun;14(3):525-8.
7. Marie-Pierre Cayer, Mathieu Drouin, et al., Comparison of promoter activities for efficient expression into human B cells and haematopoietic progenitors with adenovirus Ad5/F35. J Immunol Methods. 2007 Apr 30;322(1-2):118-27.
8. P Yotnda , H Onishi, H E Heslop, et al., Efficient infection of primitive hematopoietic stem cells by modified adenovirus. Gene Ther. 2001 Jun;8(12):930-7.
9. Akira Itoh, Takashi Okada, et al., A soluble CAR-SCF fusion protein improves adenoviral vector-mediated gene transfer to c-Kit-positive hematopoietic cells. J Gene Med. 2003 Nov;5(11):929-40.
10.Flickinger Jr, J.C., et al., Chimeric Ad5.F35 vector evades anti-adenovirus serotype 5 neutralization opposing GUCY2C-targeted antitumor immunity. Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2020. 8(2).