腺病毒感染細(xì)胞的原理是通過纖突蛋白和細(xì)胞表面CAR結(jié)合。腺病毒黏附之后，五鄰體蛋白上的精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸與細(xì)胞表面的整合素αvβ3和αvβ5結(jié)合并相互作用使腺病毒進(jìn)入細(xì)胞。Ad5腺病毒的高效感染依賴于細(xì)胞膜上的CAR和αvβ整合素，但是有些免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜上缺乏這些受體，通過研究發(fā)現(xiàn)F35血清型對造血干細(xì)胞有很強(qiáng)的靶向性，因此，嵌合型Ad5/F35由此產(chǎn)生。
對于Ad5/F35的感染效率，可以參考下面這些文獻(xiàn)中Ad5/F35的具體感染效果。
轉(zhuǎn)導(dǎo) Ad5F35-eGFP 24 小時(shí)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果圖[1]
SMMC-7721 細(xì)胞感染了 Ad5-EGFP 或 Ad5/F35-EGFP 的效果圖[2]
EBV-LCL 細(xì)胞中 Ad5 和 Ad5/F35 感染性的比較[3]
基于此，吉?jiǎng)P基因開發(fā)了一種嵌合型的腺病毒Ad5/F35，對于造血干細(xì)胞的靶向性大大增強(qiáng)。對于改造的原理方面，我們需要先了解一下腺病毒Ad5的結(jié)構(gòu)：腺病毒是一種雙鏈線性的DNA病毒，其基因組長度約36kb。基因組兩端各有一個(gè)103bp的反向重復(fù)序列（ITR）,參與病毒DNA的復(fù)制；Adv是一種無包膜的DNA病毒，其復(fù)制不依賴于宿主細(xì)胞的分裂，有50余種血清型，大多數(shù)腺病毒載體基于血清型2和血清型5，通過轉(zhuǎn)基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的復(fù)制能力。下面是人類血清型5型腺病毒基因組的示意圖：
人腺病毒血清型5的轉(zhuǎn)錄圖譜[4]
嵌合型的腺病毒Ad5/F35，在Ad5的基礎(chǔ)上，其受體結(jié)合位置的纖突改造成了F35型的纖突，下圖是Ad5/F35的結(jié)構(gòu)圖。
Ad5和 Ad5/F35 的結(jié)構(gòu)圖[5]
下圖是我們根據(jù)不同的文獻(xiàn)[6-9]，總結(jié)的對于不同的細(xì)胞Ad5/F35的MOI的推薦值。因?yàn)椴煌募?xì)胞和以及實(shí)際操作的不同，建議各位老師根據(jù)推薦的MOI做相關(guān)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定實(shí)際感染的MOI。
下面根據(jù)一篇文獻(xiàn)Chimeric Ad5.F35 vector evades anti-adenovirus serotype 5 neutralization opposing GUCY2C-targeted antitumor immunity[10]，我們可以了解一下嵌合腺病毒載體 （Ad5/F35） 誘導(dǎo)對腫瘤相關(guān)抗原鳥苷酸環(huán)化酶 C （GUCY2C） 的免疫反應(yīng)的能力。
Ad5介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)有效免疫反應(yīng)的能力使其成為針對癌癥和傳染病的實(shí)驗(yàn)性疫苗的流行載體。由于 Ad5 感染在許多人群中流行，因此全球 >70% 的人口中預(yù)先存在的 NAb 限制了基于 Ad5 的疫苗策略。這些考慮凸顯了改進(jìn)載體的必要性，所以研究人員試圖通過用罕見的腺病毒血清型 Ad35替換 Ad5 纖毛來克服預(yù)先存在的 Ad5 NAbs，以提高表達(dá)胃腸道 （GI） 癌癥抗原鳥苷酸環(huán)化酶 C （GUCY2C） 的小鼠模型中的抗腫瘤免疫力。該試驗(yàn)表明，人源化版本的疫苗（Ad5-GUCY2C-PADRE）在常規(guī)治療后安全地誘導(dǎo)了結(jié)直腸癌患者的GUCY2C特異性CD8 T細(xì)胞反應(yīng)。然而，在接種 Ad5-GUCY2C-PADRE 疫苗后，具有高 NAb 對 Ad5 的預(yù)先存在的滴度的患者未能產(chǎn)生 GUCY2C 特異性免疫。為了克服 Ad5 NAbs，研究人員生成了一種嵌合 Ad5 載體，該載體具有 Ad35 纖毛 （Ad5/F35），在小鼠和人類中具有與 Ad5 相當(dāng)?shù)陌踩院涂鼓[瘤活性以及對 Ad5 NAbs 的抗性。這種嵌合疫苗可以轉(zhuǎn)化為胃腸道癌癥患者，不僅可以在Ad5免疫力低的患者中，而且在已有的Ad5 NAbs高的患者中安全地誘導(dǎo)GUCY2C特異性免疫。
Ad5.F35-GUCY2C-S1的構(gòu)建和抗原表達(dá)
先前的研究表明，Ad5-GUCY2C疫苗在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌小鼠模型中誘導(dǎo)了保護(hù)性抗腫瘤CD8 T細(xì)胞反應(yīng)。因此，用表達(dá)GUCY2C-S1的Ad5或Ad5.F35對BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，并在7天后用表達(dá)GUCY2C和螢火蟲熒光素酶的CT26結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行攻擊。如前所述，Ad5疫苗接種幾乎消除了轉(zhuǎn)移性腫瘤負(fù)荷，延緩了疾病進(jìn)展，并提高了生存率。同樣，Ad5.F35也降低了腫瘤負(fù)荷、疾病進(jìn)展和延長生存期。重要的是，基于Ad5和基于Ad5/F35的GUCY2C疫苗在減輕腫瘤負(fù)荷、防止疾病進(jìn)展和促進(jìn)生存方面的功效相同。
Ad5-GUCY2C-S1 和 Ad5.F35-GUCY2C-S1 的抗腫瘤功效
參考文獻(xiàn)…
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