軸突再生可以在解剖學上完整的脊髓損傷（SCI）中誘導，但強大的功能恢復是難以捉摸的?；謴蜕窠?jīng)功能是否需要將軸突從特定神經(jīng)亞群定向再生到其自然目標區(qū)域尚不清楚。為了解決這個問題，瑞士聯(lián)邦理工學院（EPFL）生命科學院NeuroX研究所的研究者們應用了投射特異性和單細胞核測序來識別在不完全SCI后恢復行走的神經(jīng)細胞亞群。結果表明，化學吸引和引導這些神經(jīng)元的橫貫軸突到其自然目標區(qū)域導致小鼠在完全SCI后行走的實質性恢復。因此，重建關鍵神經(jīng)元的自然投射是旨在恢復失去的神經(jīng)功能的軸突再生策略的重要組成部分。研究成果以“Recovery of walking after paralysis by regenerating characterized neurons to their natural target region”為題，發(fā)表在Science（IF：56.9）上。
早在2018年，雖然研究團隊親眼見證了神經(jīng)元的軸突從脊髓斷裂面的一側延伸到另一側，兩側神經(jīng)元成功建立了連接，甚至連神經(jīng)電信號都部分恢復了，但遺憾的是，癱瘓小鼠的運動能力卻沒有絲毫改善。
于是，作者的研究團隊臥薪嘗膽5年，在Science新作中證明：關鍵神經(jīng)元的篩選，可以逆轉完全性截癱。下面我們來欣賞一下這篇文獻。
01表征參與自然恢復的神經(jīng)元
腰椎脊髓中負責產(chǎn)生行走的神經(jīng)亞群。通過對脊髓的單側橫切（Brown-Séquard綜合癥），這些神經(jīng)元失去了來自大腦的重要上位神經(jīng)輸入，從而導致在受傷一側無法產(chǎn)生行走。然而，無論是人類還是動物模型，在這些損傷之后都能夠恢復雙側的行走能力。作者之前的研究表明，在這種情況下，位于胸椎脊髓的神經(jīng)元通過繞過橫切處的側面，傳遞上位神經(jīng)指令以恢復行走。即使是在時間和空間上分隔的、對立的一側橫切損傷中，中斷了大腦到腰椎脊髓的所有直接投射的情況下，這些神經(jīng)元仍然能夠傳遞足夠的上位神經(jīng)輸入，以恢復雙側行走。在胸椎脊髓中切除這些神經(jīng)元并不會在沒有損傷的情況下改變行走，但會消除在單側或雙側橫切損傷后觀察到的自然恢復行走的現(xiàn)象。因此，這項研究的目的是解剖在這種自然恢復中起作用的神經(jīng)亞群的分子和解剖學特性。
作者使用重組腺相關病毒2（rAAV2）注射具有增強綠色熒光蛋白（EGFP）核膜蛋白KASH的編碼的病毒，將其注入未受傷的小鼠腰椎脊髓，以標記具有直接投射到腰椎脊髓的神經(jīng)亞群。這種策略使得可以通過熒光激活的細胞核分選聯(lián)合單核RNA測序（snRNA-seq）來獲得與特定投射的神經(jīng)亞群的轉錄組學特性。
snRNA-seq顯示 EGFP-ON神經(jīng)元主要位于胸椎神經(jīng)元中的一個腹側亞群（Hoxa7），這個亞群表達了標記Vsx2和長距離投射神經(jīng)元的標記Zfhx3。作者將這些神經(jīng)元命名為脊髓（SC）Vsx2::Hoxa7:Zfhx3→腰椎神經(jīng)元。通過對未受傷的小鼠和康復行走的小鼠的神經(jīng)核進行比較，發(fā)現(xiàn)SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰椎神經(jīng)元在所有嵌套在康復行走小鼠胸椎部分的神經(jīng)亞群中表現(xiàn)出最明顯的轉錄反應。這證明了該群體參與自然恢復過程。
02胸部中繼神經(jīng)元的連接體特征
作者使用了交叉遺傳學和在Vsx2-Cre小鼠中的病毒示蹤來比較Vsx2-ON神經(jīng)元的分布和連接組。研究發(fā)現(xiàn)，Vsx2-ON神經(jīng)元占據(jù)中胸脊髓神經(jīng)元的5.9%，對中胸脊髓Vsx2-ON神經(jīng)元的示蹤顯示了其在整個腰椎脊髓的密集投射。研究者探究了中胸脊髓Vsx2ON神經(jīng)元是否可以分成局部投射和長距離投射的亞群。在脊髓中，通過Zfhx3的表達可以區(qū)分具有局部和長距離投射的神經(jīng)元。通過在Vsx2-Cre小鼠的腰椎脊髓注入rAAV2-Ef1a-DIO-Flpo，然后注入AAV5-Con/Fon-EYFP（增強的黃色熒光蛋白）到中胸脊髓，作者成功標記了只對腰椎脊髓進行投射的Vsx2-ON神經(jīng)元。結果表明，Zfhx3和Vsx2僅在投射到這個區(qū)域的神經(jīng)元中共定位（SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→lumbar）。對Vsx2-ON神經(jīng)元的局部（Vsx2-ON，Zfhx3-OFF）與長距離投射（Vsx2-ON，Zfhx3-ON）的數(shù)量進行量化顯示，這兩個亞群在中胸脊髓神經(jīng)元中分布近乎相等。
作者推斷，作為上位神經(jīng)命令的中繼，SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰椎神經(jīng)元還必須接收來自參與癱瘓后行走恢復的關鍵上位神經(jīng)元的直接投射。為了揭示這個連接組，作者在巨細胞核中注入AAV5-CMV-TurboRFP（CMV，巨細胞病毒；RFP，紅色熒光蛋白），因為巨細胞核神經(jīng)元對于這種恢復至關重要，然后在腰椎脊髓注入rAAV2-hSyn-GFP，并標記Vsx2和vGlut2突觸小體。結果顯示，位于中胸脊髓的SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→lumbar神經(jīng)元接收來自vGi的投射，并且在自然康復后這種投射模式得以保持。
03 SCI后，軸突再生到其自然目標區(qū)域
通過用短距離或無定向再生填補損傷間隙不能簡單地實現(xiàn)完全SCI后的行走恢復，而其中一個關鍵的附加要求之一必須是將軸突推動到它們在腰椎脊髓的自然目標區(qū)域。
研究者提出了這樣的觀點，即遠距離軸突生長、成熟和突觸形成的相對緩慢時間過程可能需要比生物材料沉積提供的更持續(xù)和更高濃度的化學引導生長因子傳遞。用慢病毒介導的GDNF表達替代生物材料沉積使軸突能夠在遠離的兩個腰椎區(qū)域內進行廣泛的再生，進一步證明了適當?shù)幕瘜W引導梯度可以引導有向的遠距離軸突再生，類似于發(fā)育過程中的方式。
為了確定再生的軸突是否包括源自SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰椎神經(jīng)元的軸突，研究者將rAAV2-hSyn-KASH-EGFP注入到腰椎脊髓。這種策略在軸突已經(jīng)再生到達腰椎脊髓的神經(jīng)元中專門表達EGFP。位于損傷上方的EGFP-ON神經(jīng)元被分選出進行snRNA-seq，所得的轉錄譜被整合到我們的胸椎脊髓的圖譜中。將EGFP-ON神經(jīng)元的分布與未受傷脊髓中神經(jīng)亞群的分布進行比較，發(fā)現(xiàn)SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰椎神經(jīng)元是主要受病毒標記的亞群，確認了這一神經(jīng)亞群成功再生到其自然目標區(qū)域。追溯示蹤結合Vsx2-ON和Chat-ON神經(jīng)元的免疫標記證實了這些結果。
未受傷的小鼠表現(xiàn)出類似的投射模式，這表明再生的SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰神經(jīng)元可能本質上改變與其自然目標的適當聯(lián)系。我們還詢問，在再生SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰神經(jīng)元到達腰椎脊髓后，是否可以在解剖學上全SCI下方檢測到脊柱上的命令。我們發(fā)現(xiàn)，vGi的微刺激在腿部肌肉中誘發(fā)了大運動誘發(fā)電位，揭示了脊髓上中心已經(jīng)恢復了對腰椎脊髓的功能訪問。這些結果表明，SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰神經(jīng)元被設計為腰椎脊髓的自然目標區(qū)域再生功能性軸突。
04 解剖學上完成 SCI 后行走的大幅恢復
再生策略化學吸引并引導了參與自然恢復的分子定義的神經(jīng)元亞群重新生長到腰椎脊髓的適當目標區(qū)域，我們預計這種策略可能會在完全癱瘓后恢復行走。因此，作者在行走期間對全身運動學進行了縱向量化。在所有小鼠中，再生策略促進了從SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰神經(jīng)元到腰脊髓自然靶區(qū)的投影生長。這種再生與腿部運動的逐漸恢復相吻合，在脊髓損傷后約3至4周。最終評估在8周內進行。治療組六只小鼠中有五只表現(xiàn)出類似于不完全 SCI 后小鼠量化的步態(tài)模式。這些結果表明，我們的再生策略導致了完全脊髓損傷后行走的實質性恢復。作者不能排除這些相對不豐富的神經(jīng)元亞人群參與行走的恢復。因此，測試了SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰神經(jīng)元的必要性，其再生投影到腰脊髓的適當目標區(qū)域，以恢復后行走，因為值得注意的是，它們參與了不完全 SCI后自然恢復。為此，我們首先通過在Vsx2-Cre小鼠的胸脊髓中表達白喉毒素接收（DTR）來消融這些神經(jīng)元。SCI八周后，接受我們策略的所有小鼠都恢復了步態(tài)模式的行走能力，類似于在不完全SCI后恢復行走的小鼠的步態(tài)模式。激活白喉毒素后，解剖學分析證實了胸脊髓中Vsx2-ON神經(jīng)元的幾乎完全消融。這些重組確定了胸腔Vsx2-ON神經(jīng)元在恢復后行走恢復中的作用。然而，他們沒有確定局部與投射Vsx2-ON神經(jīng)元各自的作用。作者在此測試了在完全 SCI 后行走恢復中從 SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰椎神經(jīng)元到腰椎脊髓的項目的必要性。設計了一種交叉化學遺傳策略，一旦小鼠表現(xiàn)出行走的實質性恢復，我們就可以使再生的SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰神經(jīng)元靜音。我們將rAAV2-Ef1a-DIO-Flpo注入第四組的腰脊髓，然后將AAV5-Con/Fon-hM4Di-mCherry注入胸椎。這些小鼠都展示了行走的預期恢復。氯氮-氧化物（CNO）的給藥立即損害了所有測試小鼠的行走，導致步態(tài)模式類似于未經(jīng)歷再生的小鼠。相比之下，沒有接受AAV5-Con/Fon-hM4Di-mCherry輸注的小鼠沒有受到CNO給藥的影響。這些發(fā)現(xiàn)表明，從SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰神經(jīng)元到腰脊髓的自然目標區(qū)域的再生投影有助于完全脊髓損傷后行走的實質性恢復。
總 結
這篇文章探討了一種通過使特定的神經(jīng)元再生到其自然目標區(qū)域來實現(xiàn)癱瘓后行走恢復的方法。研究的焦點是如何通過神經(jīng)再生的方式，將受損的神經(jīng)元重新連接到其原始的目標區(qū)域，從而促使癱瘓患者重新恢復行走功能。這項研究提供了有關神經(jīng)再生對康復的潛在影響的見解，有望為治療和康復癱瘓患者的方法提供新的理論和臨床基礎。