抗米勒激素（AMH）（或米勒抑制物質，MIS）是轉化生長因子-β（TGFβ）配體超家族的成員，對胎兒發育中的性別測定至關重要。在女性中，AMH及其II型受體（AMHR2）在卵巢卵泡（包括貓卵巢）的粒細胞中高度表達。近期的研究成果認為，由腺相關病毒（AAV）載體的基因治療產生的AMH的超生理水平可以抑制成卵生成并誘導成年雌性小鼠的持久避孕。避孕機制與其他激素避孕藥不同，主要作用于卵泡發育的早期與促性腺激素無關的步驟，抑制原始卵泡激活和前卵泡的成熟。
美國俄亥俄州動物園瀕危野生動物保護和研究中心的研究者們使用載有貓抗米勒激素基因的腺相關病毒載體進行一次肌肉注射的方法，在家貓中實現長期避孕。在兩項交配研究中測量交配行為和生殖成功。結果顯示，抗米勒激素的異位表達不會影響性激素或發情周期，但阻止了繁殖引起的排卵，從而在雌性家貓中實現了安全且持久的避孕。研究成果以“Durable contraception in the female domestic cat using viral-vectored delivery of a feline anti-Müllerian hormone transgene”為題，發表在Nature Communications（IF：17.694）上。
貓AMH轉基因的優化和AAV9載體的驗證
實驗驗證：通過在裸鼠中進行腹腔注射，研究團隊發現一個月后，AMH蛋白在多個組織中表達，包括四頭肌和腹壁肌肉，以及腎臟、脾臟、胰腺和肝臟等腹腔器官。在接受AAV9-fcMISv2治療的小鼠中，卵巢較對照組更小，并且卵巢中的初級、次級和囊泡的數量明顯減少。這與先前使用人類AMH基因進行類似實驗的結果相符。這些結果表明，通過AAV9載體成功傳遞了經過優化的貓AMH基因，在小鼠中引起了AMH的高效表達，并導致卵巢發生了變化。
圖1:小鼠中的fcMISv2。
a) 密碼子優化貓AMH轉基因（fcMISv2）的設計；
b) 胎兒大鼠泌尿生殖器脊段被未經處理的雌性的H&E染色（陰性對照）；
c) 在用AAV9-fcMISv2（+）每公斤1e13病毒基因組（vg/kg）或AAV9-空載體控制（−）每公斤（vp/kg）5e12病毒顆粒治療30天后，小鼠組織WB結果；
d) 用AAV9-fcMISv2的5e12 vg/kg（藍色，圓圈）或1e13 vg/kg（紅色，正方形）治療小鼠中用ELISA測量的AMH血清濃度。n = 3個生物獨立的動物。數據預發送為平均值± SEM；
e) 用AAV9-fcMISv2的5e12 vg/kg或AAV9-fcMISv2的5e12 vp/kg治療四周后，小鼠卵巢的代表性中間部分，或AAV9-空載體對照的5e12 vp/kg；
f) 同一時間點整個卵巢的卵泡計數。
在貓中給予單劑量的第一代AAV9-fcMISv1載體會導致肌肉中延長AMH表達、可變抗轉基因抗體反應和生殖道組織邏輯變化
作者對第一代AAV9-fcMISv1載體進行的實驗。三只雌性家貓接受了該載體的治療，劑量為每公斤體重5e12個病毒顆粒。觀察到在治療后沒有明顯的疼痛或注射部位的不適。血液檢查顯示輕微的炎癥標志物上升，但迅速恢復。對AMH水平進行了4年的監測，同時也檢測了對fcMISv1的抗體。在手術后，對其中三只貓的卵巢和子宮進行了組織學檢查。其中一只貓表現出高AMH水平，抑制了卵巢功能，而其他兩只由于抗體反應和AMH水平較低，導致子宮發生異常變化。最后，對一只貓進行解剖，發現AAV9-fcMISv1在骨骼肌中的表達較高，而在肝臟中表達較少。總的來說，這項研究表明AAV9-fcMISv1對貓的治療效果在一些貓中可能更好，但在另一些貓中存在限制。
給予單劑量的AAV9-fcMISv2會導致持續分泌超生理AMH，沒有不良反應或免疫反應
研究團隊使用了第二代基因傳遞載體（AAV9-fcMISv2）來評估高水平AMH對貓生殖的影響。通過肌肉注射給予9只貓不同劑量的AAV9-fcMISv2或對照。實驗結果顯示，這一治療方案在貓身上表現出較好的耐受性，未引起明顯不適。血液檢查和生理檢查未顯示出明顯的異常，病毒基因組在體內的排泄持續了數月。與先前的基因傳遞載體相比，第二代載體未引起明顯的抗體反應。血清中的AMH水平在第一年逐漸下降，但在第二年趨于穩定，保持在高水平。這些結果表明AAV9-fcMISv2可能是一種安全有效的方法，有望對貓的生育產生影響。
圖2：家貓AAV9-fcMISv2注射的研究時間表和安全性。
a) 九只性成熟的雌性家貓接受了AAV9肌肉治療；
b) 低劑量（藍色）或高劑量（紅色）AAV9-fcMISv2或AAV9-空載體控制（黑色）后，通過qPCR在家貓的血液、口腔拭子、尿液和糞便樣本中進行病毒基因組量化；
c) 設計直接蛋白質捕獲ELISA分析的圖形表示，以測量貓血清中的抗fcMISv2 IgG；
d) 注射低（藍色方塊）或高劑量（紅色三角形）AAV9-fcMISv2或AAV9-空矢量控制（黑圈）的雌性貓的平均血清抗fcMISv2抗體滴度（黑圈）。n = 3種生物獨立動物。數據以平均值± SEM表示。“印度”（橙色加體征）的血清樣本，一種對fcMISv1提高免疫反應的女性，被用作陽性對照。
超生理AMH誘導生殖激素和卵巢循環的變化
在治療后的第8個月和第20個月啟動了兩個為期4個月的交配試驗，使用不同的雄性貓進行每個試驗。交配試驗結果：對照組的雌性貓在試驗中均懷孕并分娩，而接受AAV9-fcMISv2治療的雌性貓未分娩。通過超聲檢查確認了對照組的妊娠，而治療組未觀察到孕囊或胎兒。統計數據表明，在兩個交配試驗中，接受治療的雌性貓中，沒有出現任何分娩，而對照組產下了健康的小貓。通過卡方檢驗發現，治療組與對照組在允許交配的雌性數量、總交配次數、產生黃體期的次數、懷孕雌性數量以及總產仔數量等方面存在顯著差異。
研究結果強烈暗示，超生理水平的AMH抑制了誘導排卵，導致在貓中產生避孕效果。實驗中沒有檢測到治療組雌性貓的產仔，進一步支持了AAV9-fcMISv2作為一種潛在的避孕方法。
圖3：家貓AAV9-fcMISv2注射后的生殖激素。
a) 在整個研究過程中，每月評估每公斤AAV9-fcMISv2每公斤（vg/kg）或AAV9-空載體（對照，黑色）接受5e12病毒基因組治療的貓中AMH的平均血清濃度；
b) 低（藍色）和高劑量（紅色）組的抑制B水平，以及每公斤注射5e12 AAV9-空載體粒子（vp/kg）（對照組，黑色）的貓的抑制B水平；
c) 對每組貓在治療前（Pre-Tx，注射前最多6個月）和治療后期間收集的干燥糞便樣本中雌二醇（E2）代謝物的濃度進行了比較；
d) 根據治療前后的糞便類固醇剖面，評估發情期（≥2個連續樣本，E2 > 1.5標準差于基線平均值）頻率；
e) 血液中的黃體生成激素（LH）水平和f孕酮（P4）代謝物干糞便樣本。g根據糞便類固醇剖面評估黃體期（≥6個連續樣本，P4>1.5倍基線平均值）頻率。B-g的水平線表示平均值。
表1：在兩次單獨的交配試驗中，AAV9-fcMISv2治療的貓與對照組的育種活動、排卵和懷孕發生
總結：
這篇文章研究了一種在雌性家貓中實現持久避孕的方法。研究采用病毒載體傳遞貓抗-Müllerian激素基因，通過一次肌肉注射達到避孕效果。在實驗中，對治療后的雌性進行了兩年多的跟蹤觀察，監測了抗基因表達、抗抗基因抗體和生殖激素水平。結果顯示，這種方法不影響性激素或發情周期，但能夠阻止繁殖引起的排卵，從而在雌性家貓中實現了安全而持久的避孕效果。這一研究為發展更為高效、無創和成本效益的寵物避孕方法提供了有益的證據。