cDNA是qPCR的模板，cDNA的質量直接影響定量PCR（qPCR）的結果。提到cDNA，大家可能會用Nanodrop來測定其濃度和純度，這樣做真的是正確的嗎？cDNA質量控制的關鍵又是什么呢？今天，我們就來了解下如何把控cDNA質量。
cDNA要用Nanodrop測量濃度和純度？
用Nanodrop測量cDNA濃度和純度，這是常見的誤區之一。
首先，cDNA濃度難以準確定量。逆轉錄后的產物本身是一個混合體系，含有cDNA、未完全逆轉錄的RNA、dNTP、殘余的引物以及各種蛋白和鹽離子等成分，會干擾cDNA的吸光度，影響cDNA濃度的檢測結果。
其次，cDNA濃度并不影響qPCR實驗最終Ct值。我們以小鼠肌肉組織RNA為模板，用不同試劑盒（dNTP 組分按1 μL / 1.5 μL /2 μL /2.5 μL添加量的梯度檢測）分別進行逆轉錄實驗，起始RNA為500 ng。最后采用Nanodrop測定cDNA濃度，并取相同量cDNA分別進行qPCR實驗，結果證明：
不同逆轉錄產品的cDNA濃度相差較大，但定量實驗Ct值幾乎一致。也就是說，逆轉錄體系中dNTP 投入量的多少不會影響最終Ct值。
綜上，用Nanodrop測量cDNA濃度和純度是沒有必要的。
圖1. qPCR檢測結果△Ct＜1，且最終Ct值與Nanodrop定量結果無線性關系
質量把控關鍵：gDNA污染的識別與去除
gDNA的污染主要來源于RNA模板，只要保證RNA模板中沒有gDNA殘留，一般就不會造成gDNA污染。
那如何識別RNA模板中是否仍含有gDNA殘留呢？可以通過在逆轉錄之前將RNA模板進行瓊脂糖凝膠電泳來驗證。
如下圖所示，泳道上部有明顯的雜帶，條帶拖尾嚴重模糊不清，則顯示可能有gDNA的殘留，不建議用于后續的qPCR實驗，會對實驗結果造成影響。
圖2. 高質量RNA（左）和RNA中有gDNA（右）
如果逆轉錄前沒有確認模板中是否含有gDNA，可以在qPCR實驗中設立NRC陰性對照組（以未逆轉錄的RNA作為模板，不添加逆轉錄酶）驗證，如無gDNA污染，NRC是不會擴增的（Ct值＞35）；如果NRC擴增（Ct＜35），而體系中無cDNA，則說明擴增是由gDNA產生的，有污染。
那么發現了gDNA污染該如何去除呢？針對于此，目前主要的解決辦法是：在RNA提取時或逆轉錄前用DNA酶或gDNA清除劑去除。Arcegen CleanRNA脫氧核糖核酸酶I（2 U/uL）（N120005）可對提取后的RNA進行處理，制備無dna RNA，從源頭解決困擾；快速一鏈cDNA合成反轉錄預混液（含gDNA消化，用于qPCR）（N132062）、一鏈cDNA合成反轉錄預混液（含gDNA消化，用于qPCR）（N132061）、快速gDNA消化與反轉一步法預混液（用于qPCR）（N132063），試劑盒中包含了gDNA消化液，可以在逆轉錄前去除gDNA，十分便捷。
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