單細胞懸液是生物醫學研究中重要的實驗樣本，在單細胞懸液制備過程中，細胞凋亡和機械損傷釋放的基因組DNA，是形成黏稠團塊、導致制備失敗的主要元兇。DNase I是一種能特異性切割DNA鏈的酶，在單細胞懸液制備中，它能夠高效降解細胞外的基因組DNA，從而降低溶液黏度。今天，我們就來學習下如何利用DNase I（脫氧核糖核酸酶）制備高質量單細胞懸液。
第一步：樣本預處理
1. 對組織塊進行機械破碎和酶學消化（如使用膠原酶、胰蛋白酶等），直至組織基本分散。
2. 將初步的細胞混合物轉移至一個預冷的無菌離心管中。
3. 加入適量的預冷PBS（或特定的終止緩沖液）以稀釋和終止蛋白酶的消化反應，防止過度消化。
4. 通過適當孔徑的細胞篩（如70μm或40μm）過濾，去除未消化的大塊組織（此時的濾液有些黏稠）。
第二步：DNase I處理
1. 使用無菌的PBS稀釋DNase I原液至工作濃度。
2. 將準備好的DNase I工作液直接加入過濾后的細胞懸液，輕柔地吹打混勻，確保酶與懸液充分接觸。
3. 溫和孵育：將離心管置于37℃水浴或培養箱中，孵育 5-15分鐘。可輕柔顛倒混勻一兩次。
第三步：反應終止
1. 向離心管中加入足量的、含血清的完全培養基以終止反應。
2. 在4℃條件下，以300-500 g的離心力離心5分鐘。
3. 緩慢地倒掉或吸出上清液，注意不要擾動底部的細胞沉淀，去除DNase I以及被切割的DNA小片段。
4. 用預冷的PBS重懸細胞沉淀，再次離心并棄去上清。重復此步驟一次，以確保徹底清除DNase I。
第四步：重懸與質檢
1. 使用適量適合后續實驗的緩沖液（如無血清培養基或PBS+0.04% BSA）輕柔地重懸細胞沉淀。
2. 使用臺盼藍排除法或其他活率檢測方法進行細胞計數。此時，在顯微鏡下觀察，細胞應呈現良好的分散狀態，無明顯團塊。
3. 用移液器吸取少量細胞懸液，懸液應易于通過，無任何拉絲或黏稠感；調整細胞至目標濃度，即可準備實驗。
Tips
1. DNase I處理的最佳時機是在組織解離之后、任何精細操作（如細胞分選）之前。
2. 對于特別容易發生細胞死亡的組織（如腫瘤、腦組織），可能需要適當增加DNase I的濃度或延長孵育時間。
3. DNase I只解決DNA引起的團塊。如果團塊是由細胞表面蛋白或細胞碎片引起，則需要考慮使用其他優化解離方案。
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