RNA定量能不能準，第一步就看逆轉錄。逆轉錄引物選錯，后面qPCR再優化也白搭。今天把實驗室最常用的三類逆轉錄引物拆開講，讓你一次性搞懂該怎么選。
01 為什么引物類型會影響結果
逆轉錄引物類型決定了cDNA的合成范圍，Oligo（dT）只針對mRNA，信息完整但可能偏重3’端；隨機引物覆蓋所有RNA，背景復雜；基因特異性引物僅針對單一目標，靈敏度最高但通量低。引物選擇不當會導致目標基因檢測失敗、定量不準或背景高，從而影響實驗結果。
02 三大逆轉錄引物對比
Oligo（dT）：
Oligo（dT）是一種由多個脫氧胸苷酸（dT）串聯而成的寡核苷酸單鏈，即只含胸腺嘧啶的寡核苷酸鏈。Oligo（dT）與mRNA的Poly（A）尾巴可以發生特異性結合，因此主要用于逆轉帶有Poly（A）尾的mRNA。
優點：背景干凈，rRNA、tRNA基本不逆轉錄；有利于長鏈或全長mRNA的逆轉錄。
缺點：只能用于有poly（A）的RNA；對RNA樣品的質量要求較高，RNA降解或片段化時，5′端信息丟失，全長cDNA合成量會大量減少。
隨機引物：
隨機引物是一系列人工合成的、序列隨機的短鏈單鏈寡核苷酸混合物，一般6到8個堿基。當特定mRNA由于含有使逆轉錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。可用于mRNA、rRNA、tRNA等各種RNA的逆轉錄，對于具有復雜二級結構/GC含量較高，來源為原核生物的模板也同樣適用。
優點：適用幾乎所有RNA樣本，包括降解樣本、原核RNA、非編碼RNA等。
缺點：特異性差，可能出現假陽性；低豐度模板信號可能被“淹沒”。
基因特異性引物：
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物，需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。特異性引物通常用于一步RT-qPCR實驗中，對于低豐度基因尤其適用。
優點：特異性強，靈敏度高；無rRNA背景，qPCR模板“純度”高。
缺點：一個基因一條引物，成本高，不適合多基因；設計難度大，引物二聚體或RNA二級結構會拉低效率。
03 逆轉錄引物選擇一覽
我們根據以上信息總結了如下表格，大家可以根據表格一目了然地選擇合適的逆轉錄引物。
【注】為提高反轉錄效率，并保障獲得更加完整的cDNA，可以將Oligo(dT)和隨機引物混合使用。
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