腦中可溶性淀粉樣β肽（AβOs）的積聚已被認為與阿爾茨海默病中的突觸衰竭和記憶損害有關。在這項研究中，研究者使用NUsc1進行治療，這是一種選擇性靶向AβOs的單鏈變量片段抗體（scFv），能夠預防小鼠海馬切片中長時程增強的抑制和AβOs引起的記憶損害。
里約熱內盧州聯(lián)邦大學醫(yī)學生物化學研究所的研究者們，開發(fā)了一種腺相關病毒載體AAV-NUsc1，用于在大腦內驅動NUsc1的神經(jīng)元表達。AAV-NUsc1在成年人腦切片中誘導NUsc1的表達和分泌，并且抑制了AβOs與神經(jīng)元的結合，以及AβOs誘導的大鼠海馬原代培養(yǎng)中樹突棘喪失。用AAV-NUsc1治療小鼠阻止了AβOs引起的記憶損害，并且更重要的是逆轉了APPswe/PS1ΔE9老年阿爾茨海默病模型小鼠的記憶缺陷。研究成果以“AAV-mediated neuronal expression of a scFv antibody selective for Aβ oligomers protects synapses and rescues memory in Alzheimer models”為題，發(fā)表在Moleculat Therapy（IF：12.91）上。
研究結果
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1.NUsc1能夠預防AβOs引起的海馬長時程增強和記憶方面的損害。
首先，研究者們測試了外源性重組NUsc1是否可以阻斷AβOs引起的海馬長時程增強（LTP）的抑制和記憶損失。將小鼠海馬切片暴露于200nM的AβOs，并測量Schaeffer collaterals高頻刺激引起的LTP反應。與之前的研究一致，暴露于AβOs的海馬切片LTP受到抑制。相反，在應用AβOs之前用NUsc1處理的切片表現(xiàn)出正常的LTP。對照測量顯示NUsc1對控制組海馬切片的LTP沒有影響（即在沒有AβOs的情況下）。為了確定NUsc1是否可以預防AβOs引起的記憶損害，在小鼠的腦室內注射（i.c.v.）注入NUsc1，然后在注射AβOs前30分鐘進行i.c.v.給藥，使用新物體識別（NOR）測試評估它們的記憶。與先前的研究一致，注射AβOs的小鼠在注射AβOs后的24小時和7天都表現(xiàn)出記憶損害。相反，NUsc1處理的小鼠在注射AβOs后的24小時和7天都表現(xiàn)出正常的NOR測試結果。
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2. AAV-NUsc1的構建
接下來，研究者試圖確定AAV介導的NUsc1轉導和神經(jīng)元表達是否對AD模型具有保護作用。構建了一個AAV9載體，其中攜帶NUsc1的核苷酸序列（經(jīng)過單個氨基酸替換以在真核生物中表達），位于信號肽（SP）的下游，用于分泌途徑的導出，并由選擇性神經(jīng)元表達的synapsin I啟動子控制。通過選擇性靶向神經(jīng)元并使用3x109個AAV-NUsc1的單劑量，旨在防止NUsc1在大腦中過度表達，從而大程度地減少可能導致抗體自聚集的濃度依賴性和異常免疫或炎癥反應的潛力。
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3. AAV-NUsc1在人類成人皮質切片中誘導表達NUsc1的神經(jīng)元
為了檢驗AAV-NUsc1在AD中的轉化潛力，研究者們首先測試了AAV-NUsc1在成年人腦組織中驅動scFv抗體產(chǎn)生和分泌的能力。通過使用AAV9-mCherry對照載體進行初步測試，確認了成年人皮層切片培養(yǎng)中的蛋白表達。將成年人皮層切片暴露于不斷增加的AAV-NUsc1滴度中，顯示出NUsc1的劑量依賴性表達。通過點狀免疫印跡分析確認了NUsc1蛋白的表達和分泌到培養(yǎng)基中。結果表明，AAV-NUsc1能轉導成年人神經(jīng)元并驅動NUsc1的表達和分泌。
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4. AAV-NUsc1減少AβOs與神經(jīng)元的結合，并預防AβOs引起的樹突棘喪失
為了確定AAV-NUsc1是否能保護神經(jīng)元免受AβOs的毒性影響，研究者們首先對成熟的海馬體外培養(yǎng)14天，并進行AAV-NUsc1的轉導。由于已有報道顯示重組NUsc1可以阻止AβOs與神經(jīng)元的結合，研究者們想知道由AAV-NUsc1轉導的神經(jīng)元產(chǎn)生和分泌的NUsc1是否也能類似地阻止AβOs與神經(jīng)元的結合。試驗結果顯示，AAV-NUsc1的轉導導致海馬神經(jīng)元樹突中AβOs結合減少了約50%。
接著研究者們進一步研究了AβOs結合減少是否可以保護神經(jīng)元免受AβOs引起的樹突棘喪失。暴露于AβOs的神經(jīng)元顯示出較對照組文化減少的樹突棘密度，而在暴露于AβOs之前通過AAV-NUsc1轉導的神經(jīng)元表現(xiàn)出正常的樹突棘密度。
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5. AAV-NUsc1在小鼠AD模型中恢復了記憶。
作為在評估AAV-NUsc1在體內起效之前的對照實驗，研究者們檢查了在小鼠中i.c.v.注射AAV9-mCherry對照載體后mCherry轉基因的大腦分布和神經(jīng)元表達情況。結果顯示，AAV-mCherry誘導了mCherry在整個小鼠大腦的表達，8周后在海馬和紋狀體表達明顯。
在確認了i.c.v.注射的AAV9載體成功轉導AD相關腦區(qū)的神經(jīng)元后，接下來在小鼠中i.c.v.注射了AAV-NUsc1，并通過qPCR和免疫印跡驗證了NUsc1在他們的大腦中的表達情況。
在i.c.v.注射AAV-NUsc1或用作對照的AAV-mCherry（對照組）2個月后，動物接受了i.c.v.注射AβOs。在進行新物體識別（NOR）記憶測試時，注射AβOs的小鼠和注射AAV-mCherry后注射AβOs的小鼠均未能完成任務。相比之下，接受AAV-NUsc1轉導并注射AβOs的小鼠在NOR任務中表現(xiàn)正常。對照實驗顯示，AAV-NUsc1轉導對對照組注射車載體的小鼠在NOR測試中沒有影響。
最后，測試了AAV-NUsc1對老年APPswe/PS1ΔE9 AD模型小鼠的記憶損害的有益作用。在i.c.v.注射AAV-NUsc1后兩個月，對APPswe/PS1ΔE9小鼠（或野生型同胞）進行記憶測試。通過ELISA評估了WT和APP/PS1小鼠的NUsc1腦內水平。APPswe/PS1ΔE9小鼠在NOR測試和三箱社會交互實驗的社交記憶階段中都未能完成任務，但在三室測試的社交性階段中表現(xiàn)正常。結果顯示，接受AAV-NUsc1轉導的APPswe/PS1ΔE9小鼠在NOR和社交記憶任務中表現(xiàn)正常，表明記憶損害得到逆轉。
研究總結
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這篇文章主要介紹了一種治療阿爾茨海默病的潛在方法，使用AAV介導的神經(jīng)元表達一種選擇性靶向Aβ寡聚體的scFv抗體，該方法可以保護突觸并在阿爾茨海默病模型中恢復記憶。研究人員使用NUsc1作為scFv抗體，并通過AAV9載體在大腦內實現(xiàn)了NUsc1的神經(jīng)元表達。他們在實驗中觀察到，AAV-NUsc1轉導能降低AβOs與神經(jīng)元的結合，保護神經(jīng)元免受AβOs的毒性影響，并預防AβOs引起的樹突棘喪失。在小鼠模型中，通過AAV-NUsc1治療可預防AβOs引起的記憶損害，并且能逆轉老年阿爾茨海默病模型小鼠的記憶缺陷。這些結果表明，AAV介導的scFv抗體在治療阿爾茨海默病中具有潛在療效，并為基因介導免疫治療提供了一個有希望的治療策略
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