腦發育是一個高度協調的多區域、多譜系過程，其中神經元與血管細胞之間的互作對譜系維持、分化進程與功能形成至關重要。盡管現有腦類器官已經取得了飛速發展，能夠在體外高度模擬原代腦組織的三維結構、分子特性及發育過程，然而目前的技術多聚焦于單一腦區或采用簡化的血管模擬，難以復現多腦區協同發育與神經-血管微環境的復雜性。

2025年7月8日，約翰·霍普金斯大學研究團隊在期刊Advanced Science發表論文“Multi-Region Brain Organoids Integrating Cerebral, Mid-Hindbrain, and Endothelial Systems”，首次將皮質、中/后腦與復雜內皮組分整合，構建出具有早期血管化特征的多區域腦類器官（MRBOs）。該模型在分子與功能特征上與約40天的人類胎兒腦高度相似，使得研究者能夠動態解析多腦區協同發育與神經-血管互作。基于此平臺，團隊揭示了內皮細胞通過旁分泌支持后腦中間祖細胞發育的關鍵作用，并捕捉到了血腦屏障早期形成的標志，突出了MRBOs在研究神經發育障礙中的體外應用潛力。

研究人員從誘導多能干細胞（iPSC）出發，建立了不同的培養方案。具體而言，大腦類器官通過雙SMAD抑制進行神經誘導。內皮類器官首先通過WNT激活和BMP4刺激誘導發育為中胚層譜系，隨后通過VEGFA和FGF補充實現血管命運特異性。中/后腦類器官（MHOs）則通過特定形態發生素組合（CHIR、BMP4、IWR1 和 SANT1）實現后續模式化。第20天，三種類器官在基質膠上融合。光片顯微鏡確認了多區域腦類器官（MRBOs）的成功整合。

單核RNA測序確認，MRBOs中存在多個神經細胞群體以及內皮細胞類型，并強調了神經和血管組分的成功整合。更重要的是，在單核RNA測序數據的整合分析中，MRBOs與人類胎兒大腦的細胞群簇有80%重疊，顯示出極高的基因表達相似性和生物學相關性。

以上結果證明，實驗獲得的MRBOs與原代組織具備足夠的相似性，可作為體外研究的堅實平臺。更重要的是，不同實驗系之間，不同細胞類型標記物的平均整體可重復性為68.47%，證明MRBOs能夠穩健地模擬神經發育過程。

圖：MRBOs的生成和分子表征

為了全面表征細胞異質性并驗證不同腦區的成功整合，研究人員對多種不同的類器官模型進行了單核RNA測序，包括單獨的大腦皮層類器官，內皮類器官和中/后腦類器官，以及部分融合后的組裝體（如大腦皮層+內皮類器官、中腦/后腦+內皮類器官、大腦皮層+中腦/后腦類器官等）和完整的MRBOs。

他們共發現了九個不同的簇，差異表達分析突出了關鍵基因的表達，如VEGFA（血管化標記物）、CUX1（皮層神經元標記物）和HOXB3（后腦標記物）等，說明區域性細胞特異性身份得以保留。

不同組裝體也各自展現出獨特的簇結構，如內皮與中/后腦融合的Endo-MHO中揭示了七個不同的簇（包含VEGFA、TCF4、HOXB3等標記），內皮-皮層類器官和單獨的MHO各有六個簇，表明其各自成功分化出特定細胞類型。以上所有簇顯示出明顯的分離，確認了簇之間的清晰邊界和最小重疊，進一步驗證了MRBOs共培養方案的特異性和準確性。

圖：MRBO、MHO、內皮和大腦類器官的轉錄組表征

在30天的觀察期內（第35至第65天），多區域腦類器官（MRBOs）表現出神經功能的顯著增強，具體包括尖峰頻率和爆發率顯著上升、尖峰間隔（ISI）縮短，反映出更高頻、更同步的神經網絡活動。相比之下，單獨由大腦皮層或中腦/后腦構成的類器官發育軌跡更為緩和。

綜合來看，MRBOs在神經電活動的多個維度上展現出最顯著的動態變化，提示其不僅實現了不同腦區的共存，更形成了功能性的整合網絡，表明其足以成為研究發育性神經疾病與功能障礙的更具生物學相關性的類腦模型。

圖：不同腦類器官類型的神經網絡成熟度和電生理發育

此前研究已指出，內皮細胞在中樞神經系統形態發生中具有關鍵作用。本文觀察到后腦關鍵調控基因 HOXB3 的表達增強與內皮成分增加呈關聯，提示內皮細胞可能參與后腦譜系調控。

為探索這一關系，研究者整合了多區域腦類器官（MRBOs）、內皮類器官與中腦/后腦類器官及其組合的轉錄組數據，識別出一個僅在含內皮組分條件下出現的特異性細胞簇（簇6，高表達多種內皮標記）。該簇通過VEGF、BMP、PDGF和IGF信號通路協調多個后腦發育途徑，既是BMP、IGF等信號的主要產生源，又在VEGF軸中表現自分泌及接受外源信號的能力，凸顯其在早期神經-血管互作與血管化支持中的樞紐角色。

進一步分析發現，僅在包含內皮的類器官中出現的后腦中間祖細胞簇，其發育過程中也依賴于內皮旁分泌信號以維持與擴增，由此表明內皮信號是后腦中間譜系協調進展的必要條件。

相比之下，內皮成分對大腦（前腦）類器官發展影響有限，表明其作用具有區域特異性。

圖：內皮細胞調控的信號通路

血腦屏障由腦毛細血管內皮細胞通過緊密連接構成，并在基底膜、周細胞與星形膠質足突的支持下形成高度選擇性的屏障，限制大分子和有害物質向腦實質滲透，同時維持神經微環境穩態。血腦屏障的破壞與多種神經系統疾?。ㄈ缒X血管病、神經退行性疾病和神經發育障礙）密切相關，因此在體外重建其早期發育過程對于機制研究具有重要意義。

在MRBOs中，活細胞成像（Dil-Ac-LD）捕捉到了早期血腦屏障形成事件，并發現了與之一致的細胞和分子特征?；虮磉_分析配合免疫組化驗證顯示，緊密連接蛋白ZO-1在MRBOs中表達，提示屏障結構的初步建立。兩個多月成熟的切片同時呈現多種血管/內皮標記（CD34、VEGFR2、CD31、PDGFβ），支持血管化進展與成熟。

上述多模態證據共同確認，MRBOs中存在血腦屏障早期發育的分子與細胞標志，表明該體系可用于模擬血腦屏障形成并為相關疾病研究提供新的模型與視角。

圖：MRBO中血腦屏障的早期發育

本研究開發的多區域腦類器官（MRBOs）模型，以其高度的區域特異性和細胞多樣性，為研究人類大腦發育和神經發育障礙提供了強大的工具。MRBOs與人類胎兒大腦的相似性高達80%，使其成為研究復雜神經發育事件的理想模型。此外，該模型還揭示了內皮細胞在區域大腦發育中的關鍵作用，特別是在后腦發育中對中間祖細胞的維持和支持。這一發現不僅增進了我們對神經血管發育的理解，還為治療中腦/后腦發育相關疾病提供了新的策略。

盡管MRBOs在模擬大腦發育方面取得了顯著進展，但研究人員也指出了其局限性。目前的模型尚未完全形成血管網絡、長距離軸突投射以及功能性血腦屏障的驗證。然而，即使在延長培養時間以促進回路形成的情況下，MRBO模型已經為轉化應用提供了顯著優勢。未來的研究將致力于引入更多的細胞類型，特別是小膠質細胞和其他免疫細胞，以進一步增強模型的生理相關性，并擴大其在研究中的應用范圍。