100年前西班牙科學(xué)家P?′o del R?′o-Hortega在一次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一種新的細(xì)胞類型是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，他稱其為小膠質(zhì)細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兊捏w細(xì)胞很小，比星形膠質(zhì)細(xì)胞小得多。自此以后小膠質(zhì)細(xì)胞開始成為神經(jīng)細(xì)胞的一員，慢慢進(jìn)入人們的視野。最近的二十年科學(xué)家[1]目光主要聚焦在小膠質(zhì)細(xì)胞在大腦中生理學(xué)和病理學(xué)中的作用。小膠質(zhì)細(xì)胞的一個(gè)顯著特征是其運(yùn)動(dòng)性，可對(duì)大腦微環(huán)境進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測。此外小膠質(zhì)細(xì)胞可以進(jìn)行突觸修剪，尤其是在在發(fā)育期。在病理情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞執(zhí)行經(jīng)典的免疫功能，釋放炎性因子和吞噬細(xì)胞碎片（凋亡細(xì)胞，軸突和髓磷脂廢物）。小膠質(zhì)細(xì)胞能夠與神經(jīng)元類型發(fā)生聯(lián)系：影響神經(jīng)元連接及功能；參與神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）和神經(jīng)發(fā)生；促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞生長、髓鞘形成、髓鞘再生 ；促進(jìn)血管生成；星形膠質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障的通透性等等系列作用。
目前可通過敲入基因的手段實(shí)現(xiàn)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記，通過病毒載體工具實(shí)現(xiàn)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性操縱。基于病毒的基因傳遞系統(tǒng)的兩個(gè)主要組成部分是：首先由結(jié)構(gòu)蛋白和酶組成的包裝元件，合成病毒；其次，在細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子下驅(qū)動(dòng)的編碼感興趣基因的轉(zhuǎn)移載體。早期借助AAV6為載體，F(xiàn)4/80和 CD68為啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)特異性標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，但是感染細(xì)胞的效率低、存在部分脫靶、引起組織免疫反應(yīng)等問題。
2022年7月25日北京生命科學(xué)研究所羅敏敏/林睿團(tuán)隊(duì)開發(fā)了高效、便捷、一體化操縱小膠質(zhì)細(xì)胞的AAV病毒載體工具，極大促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的功能研究[2]。
文中介紹的AAV新血清MG1.2，不僅能夠高效標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，而且不引起小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。
吉?jiǎng)P基因結(jié)合多年的經(jīng)驗(yàn)，今天為大家推薦在野生型小鼠標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞的方案：AAVMG1.2-F4/80，局部注射1ul/位點(diǎn)，1E+13vg/ml，建議小伙伴先做預(yù)實(shí)驗(yàn)。
為了進(jìn)一步增加小膠質(zhì)細(xì)胞的靶向策略，借助轉(zhuǎn)基因小鼠，CX3CR1-Cre小鼠+AAV-DIO的策略，是當(dāng)前標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞的第一梯隊(duì)方案[3]。
本文中，作者將兩對(duì)反向的loxp位點(diǎn)，插入到EGFP兩端，構(gòu)建在AAV6中，借助AAV6注射到CX3CR1-Cre小鼠的腦中，高效標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞。1ul/位點(diǎn)，1E+13vg/ml。綜合兩篇文獻(xiàn)，我為老師們推薦的是AAVMG1.2-CAG-DIO，注射到CX3CR1-Cre小鼠的腦中。
AAV-DIO系統(tǒng)，除了介導(dǎo)CX3CR1-Cre小鼠的基因敲低，還可以介導(dǎo)CX3CR1-Cre小鼠的基因過表達(dá)[4]。
在這篇文獻(xiàn)中，作者將目的基因轉(zhuǎn)錄本的兩端插入了，兩對(duì)相向的loxp位點(diǎn)后，一同構(gòu)建進(jìn)入AAV，將AAV注入CX3CR1-Cre小鼠的腦內(nèi)，最終達(dá)到了在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)目的基因ANXA1的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。其?shí)，CX3CR1-Cre小鼠本身就具有小膠質(zhì)細(xì)胞的靶向特異性，所以在AAV-DIO系統(tǒng)中，選擇廣譜啟動(dòng)子CAG就足夠。
公眾號(hào)底部菜單欄【新功能】上線！
病毒實(shí)驗(yàn)幫
免費(fèi)在線學(xué)習(xí)《國自然熱點(diǎn)研究》、《數(shù)據(jù)庫及軟件操作教程》
一鍵下載《病毒使用手冊(cè)》、《高分文獻(xiàn)》
還有不定時(shí)的送新書、抽獎(jiǎng)活動(dòng)，趕緊來掃碼關(guān)注一波吧
總結(jié)一下，老師們?nèi)绻氚邢蛐∧z質(zhì)細(xì)胞，首推AAVMG1.2-CAG-DIO+CX3CR1-Cre小鼠的方案。如果為了補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，時(shí)間不充足，次推AAVMG1.2-F4/80，注射到野生型小鼠的腦中。想了解AAV是如何助力Cre-loxp系統(tǒng)，加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)程的老師們，可以觀看吉?jiǎng)P基因B站上的直播回放（點(diǎn)擊查看）。感興趣的老師，還可以聯(lián)系吉?jiǎng)P后臺(tái)領(lǐng)取PPT。祝老師們實(shí)驗(yàn)順利，生活愉快。
【參考文獻(xiàn)】
[1].Amanda Sierra, Rosa C. Paolicelli, and Helmut Kettenmann，Cien An? os de Microgl?′a: Milestones in a Century of Microglial Research；Trends in Neurosciences, November, Vol. 42, No. 11.
[2].Lin R, Zhou Y, Yan T, Wang R, Li H, Wu Z, Zhang X, Zhou X, Zhao F, Zhang L, Li Y, Luo M. Directed evolution of adeno-associated virus for efficient gene delivery to microglia. Nat Methods. 2022 Aug;19(8):976-985. doi: 10.1038/s41592-022-01547-7. Epub 2022 Jul 25. PMID: 35879607.
[3].Mao M, Xia Q, Zhan GF, Chu QJ, Li X, Lian HK. SENP6 induces microglial polarization and neuroinflammation through de-SUMOylation of Annexin-A1 after cerebral ischaemia-reperfusion injury. Cell Biosci. 2022 Jul 22;12(1):113. doi: 10.1186/s13578-022-00850-2. PMID: 35869493; PMCID: PMC9308285.
[4].Zheng L, Wang Y, Shao B, Zhou H, Li X, Zhang C, Sun N, Shi J. Multiple Mild Stimulations Reduce Membrane Distribution of CX3CR1 Promoted by Annexin a1 in Microglia to Attenuate Excessive Dendritic Spine Pruning and Cognitive Deficits Caused by a Transient Ischemic Attack in Mice. Neurosci Bull. 2022 Jul;38(7):753-768. doi: 10.1007/s12264-022-00847-4. Epub 2022 Mar 30. PMID: 35352285; PMCID: PMC9276903.