上期我們對Cre-loxP系統做了原理和應用的基礎介紹，了解了這個系統適用的場景和范圍以及如何獲得轉基因動物。以上都是依賴于Cre酶從而實現基因的敲低和過表達，要想實現特定時間的基因的啟動需要更加精準的誘導型的Cre-lox系統。
更加精準的誘導型Cre-lox系統
1. CreER重組酶系統
CreER重組酶系統是由Cre重組酶和雌激素受體（estrogen receptor, ER）的激素結合域相融合組成。在沒有雌激素類似物Tamoxifen的情況下，Cre酶、雌激素受體配體結合域和熱休克蛋白綁定在一起，存在細胞質中。當存在Tamoxifen時，熱休克蛋白被排擠掉，Cre酶和雌激素受體的結合體蛋白可以進入細胞核，Cre酶發揮作用。
圖1：tamoxifen誘導的Cre-ER系統[1]
2. Cre;Tet系統：
四環素（Tetracycline,Tet）誘導系統是由E.coli大腸桿菌中Tn10轉座子改造而來，可依賴四環素進行可逆地調控基因表達。
該系統在大腸桿菌中由四環素阻遏蛋白（Tet repressor, TetR）和Tet操縱子（Tet operator, TetO）組成：在缺乏四環素Tc以及其衍生物強力霉素Dox的情況下，TetR二聚體和TetO結合，阻斷基因表達；當Tc或者Dox與TetR結合時，誘導TetR構象變化，導致其與TetO分離促進基因表達。
圖2：Cre;Tet系統作用原理[2]
該系統有兩種模式：Tet-on和Tet-off。
在Tet-on系統中，TetR被改成rtTA，在Dox存在時，可以和rtTA結合并激活，激活的rtTA與TRE序列結合誘導Cre的表達；在沒有Dox情況下，失活的rtTA無法與負責調控Cre基因的TRE序列結合，則Cre不表達。
圖3：Dox誘導的Cre;Tet-on系統[1]
在Tet-off系統中，在沒有Dox情況下，激活的rtTA能夠結合Cre基因的TRE序列，誘導Cre表達。在Dox給藥之后，與Dox相互作用的Tta被滅活，不再與TRE結合，因此Cre表達受到抑制。
圖4：Dox誘導的Cre;Tet-off系統[1]
基于Cre-loxP系統的工具病毒方案
基于以上的缺點，現如今越來越多的科研工作者選擇新的方式來構建條件性基因敲除小鼠，即病毒依賴的Cre-loxP重組系統，以局部注射的方式實現更強的區域特異性、更少的花費以及更短的實驗周期?；贑re-loxP系統的工具病毒方案具體為下圖兩種：
1. 將表達Cre的病毒注射入轉基因獲得Floxed小鼠
可以通過轉基因技術獲得條件性基因敲除小鼠Floxed小鼠，再通過構建廣譜或者組織特異性的Cre載體病毒，從而實現全身或者組織特異性的基因敲除。
圖5：給予條件floxed鼠注射Cre依賴表達載體實現細胞特異性過表達
2.將表達loxP的病毒注射入轉基因獲得Cre小鼠
首先獲得條件Cre的小鼠，再將表達loxP位點的病毒注射入小鼠體內，實現基因的過表達或者干擾。常用的Cre依賴表達系統：DIO序列策略 & LSL序列策略。
如下圖：2019 年慕尼黑大學生物醫學中心的研究人員在 Neuron 上發表研究成果，該研究中作者就基于已有的星形膠質細胞特異性表達 Cre 的小鼠，構建了 Cre 依賴表達的 AAV-FLEx-Ngn2/Nurr1，注射到小鼠腦內后在星形膠質細胞中特異性的過表達了 Ngn2 和 Nurr1。圖A中目標序列如果換成shRNA序列則可以實現組織特異性目的基因的干擾。
圖7：給予條件Cre鼠注射Cre依賴表達載體實現細胞特異性過表達[3]
根據以上的介紹，我們可以了解到：當我們有flox鼠或條件Cre鼠時，通過工具病毒載體就可以快速獲得想要的基因調控小鼠，小鼠與對應的工具病毒總結如下表，老師們可以根據自己的需要進行工具病毒的選擇：
小編總結
學習完Cre-loxP系統相關的知識，小編不禁感慨Cre酶和loxP位點的應用十分的巧妙。對于基因敲除鼠的培育讓我們可以獲得想要的基因型的老鼠，而在此基礎上工具病毒的使用又極大的縮短了實驗的時間，吉凱基因提供廣泛的工具病毒，滿足不同課題的設計需要，能夠進一步縮短各位老師們的實驗周期，感興趣的老師們快來咨詢吧?。?
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【參考文獻】
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