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實時熒光定量PCR（qPCR）是現(xiàn)代分子生物學實驗室的“扛把子”技術，應用極其廣泛。然而，它也是一個細節(jié)決定成敗的實驗，那么，qPCR實驗有哪些需要注意的地方呢？今天我們就來一起看下。

核酸提取質量控制

低質量的RNA模板會從多個方面干擾實驗結果，可能造成假陽性或者假陰性，因此應在核酸提取完成后，立即進行質檢：先用分光光度計測定濃度與純度；隨后用瓊脂糖凝膠電泳評估完整性，理想結果應為清晰、無拖尾的單一條帶。

1.分光光度計檢測：
對于A260/280：如果1.9< A260/280< 2.1，說明RNA純度較好；A260/280<1.9，表示RNA中可能有蛋白殘留；A260/280>2.1，表示RNA可能有部分降解，可經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進一步確認。
對于A260/230：如果2.0< A260/230< 2.2，說明RNA純度較好；A260/230< 2.0，則說明RNA中可能有機試劑殘留，如酚、乙醇或糖類等。

2.瓊脂糖凝膠電泳：
以真核生物為例，若膠圖上只有28sRNA、18sRNA和5.8sRNA三條單一的條帶，說明提取的RNA完整度良好；如果出現(xiàn)拖帶的現(xiàn)象，表示RNA部分降解；若膠孔內(nèi)出現(xiàn)條帶，說明可能有蛋白等大分子物質殘留。

引物設計與準備

qPCR引物設計的好壞，直接關乎著擴增效率和產(chǎn)物特異性，是決定實驗結果的關鍵因素。

引物的設計通常遵循以下原則：
1.目的片段長度控制在100 - 300 bp；
2.跨外顯子設計，避免擴增gDNA；
3.上下游引物Tm值差異≤1℃；
4.GC含量40-60 %，極端GC會拉高或拉低Tm；
5.設計的引物需要進行擴增效率的檢測，擴增效率達標（90-110%）才可用于定量實驗；
6.引物濃度通常在0.1μM-1.0μM之間優(yōu)化選擇。

內(nèi)參基因選擇

qPCR內(nèi)參基因要選擇適合自己試驗體系的、特異性穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，常見的有以下幾種：

1.GAPDH/β-actin：傳統(tǒng)常用，但代謝相關或增殖實驗時可能不穩(wěn)定，必須驗證；

2.18S rRNA：表達豐度高，適用于總RNA量少的情況，但可能不適用于某些處理；

3.HPRT1/PPIA：在多種細胞和組織中表達相對穩(wěn)定，是較好的初選對象；

4.YWHAZ/TBP：穩(wěn)定性通常優(yōu)于傳統(tǒng)內(nèi)參，尤其適用于發(fā)育、癌癥等研究。

反應體系配置

反應體系優(yōu)先推薦20μL和50μL。配置時要注意以下事項：

1.將試劑（酶、buffer、引物等）先混合再分裝，減少加樣誤差和孔間差異；
2.每次實驗都需要配制NTC（No Template Control，無樣本對照）來驗證體系中是否存在污染，配置體系時每一對引物都需要做NTC；
3.如果想檢測RNA模板是否有gDNA殘留，可將每個樣本都配制NRT（No Reverse Transcriptase Control，無逆轉錄酶對照）進行檢測；
4.模板為cDNA時，建議稀釋5-10倍，減少反轉錄體系對qPCR實驗的抑制作用，模板量預先進行梯度摸索，使CT值落在20-30之間最佳。

反應程序設定

不同的熒光定量酶反應條件不一樣。常見的有配體法熱啟動酶和抗體法熱啟動酶，關于這兩種酶反應條件的設定需要注意以下幾點：

1.設置程序時要注意配體法的預變性為95℃，5min；抗體法的預變性為95℃，30min；
2.兩步法可保證產(chǎn)物高特異，三步法可保證高效率擴增，可根據(jù)需求選擇；

3.上機時盡量避免使用最外面一圈的孔。

以上就是對qPCR注意事項的總結，希望能夠對大家的實驗有所幫助。還有其他問題，歡迎評論區(qū)討論哦。

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