雙螢光素酶報告基因檢測（DualLuciferaseReporterAssay）廣泛應用于啟動子活性分析、轉錄因子調(diào)控研究、miRNA靶向驗證等實驗。然而，由于實驗流程復雜，涉及載體構建、細胞轉染、裂解檢測等多個環(huán)節(jié)，容易出現(xiàn)各種問題。本文將系統(tǒng)梳理常見失敗原因及解決方案，幫助大家高效完成實驗。
01 發(fā)光值過高或過低
1.發(fā)光值過高
樣品本身發(fā)光值高：發(fā)光值過高可能會超出儀器檢測范圍，從而檢測不到值，一般讀數(shù)在5-6位之間較好。
解決方案：
a.減少質粒轉染量；
b.細胞樣品裂解后，離心取上清后對裂解產(chǎn)物進行稀釋后檢測。
2.發(fā)光值過低
1）轉染效率太低：報告基因質粒無法成功進入細胞或較少進入細胞，會導致檢測出的發(fā)光值較低。
解決方案：
a. 優(yōu)化轉染條件，用較易轉染的質粒做陽性對照（如轉染過表達螢光蛋白質粒）；
b. 確保轉染DNA的質量，可通過酶切或瓊脂糖凝膠電泳的方法對DNA質量進行鑒定；
c. 選擇狀態(tài)較好，處于對數(shù)分裂期的細胞進行轉染；
d. 選擇合適的轉染試劑。
2）載體選擇不當：螢火蟲螢光素酶載體啟動子活性不足，導致信號過低；海腎螢光素酶（RenillaLuciferase）使用強啟動子（如CMV/SV40），干擾主報告基因檢測。
解決方案：
a.螢火蟲螢光素酶：推薦使用pGL3、pGL4或pmirGLO載體，確保啟動子活性。
b. 海腎螢光素酶：建議選用phRLTK或pGL4載體，采用中等強度啟動子（如TK）。
3）載體比例失衡：螢火蟲與海腎螢光素酶質粒比例不當，導致內(nèi)參信號過高或過低。
解決方案：
預實驗優(yōu)化比例，確保表達后的螢火蟲螢光素酶信號顯著高于海腎螢光素酶信號。
4）裂解不充分：細胞裂解不完全，螢光素酶未充分釋放。
解決方案：
a.裂解液足量，冰上裂解5-10min，可適當吹打，確保細胞完全破碎。
細胞培養(yǎng)時間不宜過長，12-36h內(nèi)最好，長時間培養(yǎng)后，細胞可能會難裂解。
5）檢測過程操作不規(guī)范：不規(guī)范的檢測條件也有可能使得讀值偏低。
解決方案：
a. 需加入足量底物，保證底物飽和，否則會造成結果偏差；
b. 室溫反應，反應時各個組分（細胞裂解產(chǎn)物，底物工作液等）都需要調(diào)整到室溫；
c. 加完底物后可立即檢測，螢光素酶的半衰期一般約30min，盡量在30min內(nèi)完成，否則讀值會偏小。
6）底物氧化失效：無法正常進行反應。
解決方案：
a. 底物避光密封保存，螢火蟲熒光素酶底物-20℃保存，海腎熒光素酶底物推薦-80℃保存；
b. 反應工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。
02 不同復孔發(fā)光值差異大
1.樣本均一性不好：
由于操作誤差導致每孔細胞數(shù)不一致、細胞狀態(tài)差異等，導致每孔檢測結果差異較大。
解決方案：
a. 細胞裂解后建議離心取上清，保證樣本的均一性；
b. 移液器需定期校準，確保移液精準；
c. 接種細胞時嚴格進行細胞計數(shù)；
d. 避免氣泡出現(xiàn)。
注：熒光素酶報告基因實驗的檢測結果非常靈敏，復孔之間的數(shù)值有一定差異是正常的，一般認為在同一個數(shù)量級的差異是可以接受的。
雙螢光素酶實驗結果的好壞取決于載體設計、轉染效率、裂解條件、檢測方法等等。通過優(yōu)化實驗流程，并選擇高穩(wěn)定性檢測系統(tǒng)，即可顯著提升檢測成功率。
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