在選擇CRISPR/Cas系統(tǒng)的遞送技術(shù)之前，首先得確認(rèn)Cas蛋白和sgRNA的生物形式，它有3種不同的生物形式能被遞送至細(xì)胞內(nèi)，分別是質(zhì)粒DNA、mRNA和核糖核蛋白（RNP）形式。

pDNA（質(zhì)粒DNA）是 CRISPR/Cas系統(tǒng)最常用的一種形式。以最主流的CRISPR/Cas9系統(tǒng)為例，首先設(shè)計CRISPR質(zhì)粒DNA，包含啟動子、Cas9基因序列、sgRNA序列等。之后通過轉(zhuǎn)染技術(shù)，讓質(zhì)粒在NLS的幫助下進入細(xì)胞核，通過轉(zhuǎn)錄形成Cas9 mRNA和sgRNA，Cas9 mRNA被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中翻譯成Cas9蛋白，隨后Cas9蛋白與sgRNA結(jié)合形成復(fù)合物，啟動后續(xù)的基因編輯。

近岸蛋白提供CRISPR質(zhì)粒構(gòu)建時需要的同源重組克隆試劑盒(Cat.No.NR005)，能做到1-5片段無縫克隆，最快僅需10min完成克隆連接，無假陽性，菌落數(shù)多。

mRNA形式的工作原理是通過體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)（IVT）在體外合成Cas9 mRNA以及sgRNA，并進行化學(xué)修飾，包括5’端加帽、核苷酸修飾（如假尿苷修飾）及3’端Poly（A）尾等。mRNA直接進入細(xì)胞質(zhì)，繞過轉(zhuǎn)錄步驟，由核糖體立即翻譯為功能蛋白。同時遞送的修飾sgRNA與新生Cas9快速組裝成復(fù)合物，切割靶DNA。其優(yōu)勢在于瞬時表達(dá)，通過核苷酸修飾（如N1-甲基假尿苷）降低免疫原性，但需LNP等載體保護免受核酸酶降解。

近岸蛋白研發(fā)的Cas9 mRNA (N1-Me-Pseudo UTP) （Cat.No.MR019）不僅在N端和C端分別加入核定位信號NLS，提高DNA切割速率，并且加入N1-甲基假尿苷替換原有的UTP，有效降低mRNA在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的免疫原性，增強mRNA的穩(wěn)定性。

圖例）Cas9 mRNA (N1-Me-Pseudo UTP)轉(zhuǎn)染24h后，293T細(xì)胞中的編輯效果，細(xì)胞因Cas9活性發(fā)出綠色熒光，簡單快速，mRNA轉(zhuǎn)染效率穩(wěn)定。

核糖核蛋白是指Cas9蛋白與sgRNA的復(fù)合物，又稱為RNP。首先在體外合成Cas9蛋白和sgRNA，并將他們結(jié)合形成RNP復(fù)合物，之后作為單個貨物直接通過電轉(zhuǎn)或者脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)染技術(shù)遞送至細(xì)胞中，避免了與pDNA或mRNA遞送相關(guān)的許多陷阱，如pDNA會有整合至基因組的風(fēng)險，mRNA穩(wěn)定性差等。RNP遞送無需細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯，因此可實現(xiàn)最快速的基因組編輯。

近岸蛋白專門為CRISPR/Cas系統(tǒng)的RNP體系開發(fā)的Cas蛋白及其突變體，不僅含有NLS核定位信號，蛋白純度≥95%，活性高，體外切割效率達(dá)90%，內(nèi)毒素低，能在72h內(nèi)完全降解，可有效降低脫靶效應(yīng)，提高基因編輯敲入或者敲除的效率。再加上通用型一步法sgRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（Cat.No.E399），快速制備CRISPR/Cas系統(tǒng)所需的兩大元件，可以實現(xiàn)即時快速的基因編輯。

大家了解了CRISPR/Cas系統(tǒng)的生物形式，那么如何將這些不同的CRISPR/Cas系統(tǒng)生物形式遞送至細(xì)胞中呢？這就需要通過不同的遞送技術(shù)，包括物理轉(zhuǎn)染法、化學(xué)轉(zhuǎn)染法和病毒載體轉(zhuǎn)染法。

01 顯微注射法

顯微注射法是指在顯微鏡下將微量的核酸通過專門的儀器注射到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，從而實現(xiàn)核酸的導(dǎo)入。其操作流程是制備RNP體系/mRNA/Cas9質(zhì)粒，使用顯微注射儀注入細(xì)胞中，培養(yǎng)并分析編輯效率。該技術(shù)最重要的用途是將核酸引入卵母細(xì)胞、卵細(xì)胞和動物胚胎中，常用于制備轉(zhuǎn)基因動物和基因瞬時表達(dá)分析。

02 電穿孔法

電穿孔法是將細(xì)胞暴露在短暫的高場強脈沖電場中，通過在細(xì)胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的方法。其操作流程是將細(xì)胞與CRISPR組分（RNP或Cas9質(zhì)粒）混合，加入電穿孔緩沖液，施加脈沖電壓，即可瞬轉(zhuǎn)至細(xì)胞中。脈沖的大小和持續(xù)時間決定了轉(zhuǎn)染效率，對于不同的細(xì)胞系，必須經(jīng)過優(yōu)化驗證來確定電轉(zhuǎn)條件，該方法轉(zhuǎn)染效率高，適用性廣，不受細(xì)胞種類的限制，但是需要昂貴的儀器進行實驗，且細(xì)胞死亡率較高。

電穿孔法瞬時轉(zhuǎn)染原理圖

（Du, Xiaofan & Zhou et al. 2018）

01 DEAE－葡聚糖法

DEAE-葡聚糖是最早開發(fā)的轉(zhuǎn)染試劑之一。它是一種可溶的聚陽離子碳水化合物，通過與帶負(fù)電的DNA結(jié)合形成聚集物。適用于Cas9質(zhì)粒DNA的遞送。攜帶正電荷的復(fù)合物與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜結(jié)合，使復(fù)合物通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用進入細(xì)胞中。

02 磷酸鈣法

該技術(shù)通過將磷酸鹽溶液和含有DNA的氯化鈣溶液進行緩慢混合，形成DNA-磷酸鈣共沉淀復(fù)合物。適用于Cas9質(zhì)粒DNA的遞送。復(fù)合物能粘附于細(xì)胞膜上，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進入細(xì)胞中。

03 陽離子脂質(zhì)體法

脂質(zhì)體分為單層脂質(zhì)體和多層脂質(zhì)體。常用的陽離子脂質(zhì)體與帶負(fù)電的DNA結(jié)合，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物，從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進入細(xì)胞。其操作流程是將Cas9質(zhì)?；騧RNA與脂質(zhì)體混合，孵育形成脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，37°C孵育24-48小時，檢測編輯效率。

脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染原理圖（Parker et al. 2003）

化學(xué)轉(zhuǎn)染法能夠在活體內(nèi)應(yīng)用，對細(xì)胞毒性較低且細(xì)胞存活率較高、實驗重復(fù)性好。適用性廣，已經(jīng)被廣泛用于將pDNA和mRNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，在很多細(xì)胞中能得到有效的瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效果。但是該試劑有著難以自制，價格較為昂貴，轉(zhuǎn)染效果在不同細(xì)胞類型中差異較大等缺點。

01 慢病毒

慢病毒載體系統(tǒng)是一種能非常高效地把外源基因穩(wěn)定整合到哺乳動物細(xì)胞中的載體工具。除了常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染外，目前該系統(tǒng)也是把外源基因轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞的最常用方法之一。由于具有目的基因和啟動子選擇的靈活性以及轉(zhuǎn)染細(xì)胞類型的廣泛性兩大特點，使其成為應(yīng)用范圍較廣的外源基因表達(dá)系統(tǒng)。慢病毒載體來源于人類免疫缺陷病毒HIV，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒家族，而目前通過改造優(yōu)化，慢病毒載體刪除了與病毒包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因，因而具有很高的生物安全性。適用于Cas9質(zhì)粒DNA的遞送。

當(dāng)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞時，釋放到宿主細(xì)胞中的病毒RNA借助逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，然后隨機整合進宿主細(xì)胞的基因組中。在病毒載體中，位于兩個LTR的DNA片段和病毒基因組都會穩(wěn)定整合到靶細(xì)胞的基因組中。

02 腺病毒

腺病毒載體是應(yīng)用較為廣泛的病毒載體系統(tǒng)。腺病毒對大多數(shù)細(xì)胞都有很高的感染效率，包括分裂和不分裂細(xì)胞及原代細(xì)胞，除了卵細(xì)胞以外幾乎在所有已知細(xì)胞中都不整合到染色體中，因此不會干擾其它的宿主基因。當(dāng)腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞時，兩個ITR之間的外源DNA及病毒基因組一起進入細(xì)胞，并以游離DNA的形式存在于細(xì)胞核中。由于腺病毒基因組不整合到宿主的基因組，所以腺病毒在宿主體內(nèi)是瞬時表達(dá)。適用于Cas9質(zhì)粒DNA的遞送。

03 腺相關(guān)病毒

腺病毒相關(guān)病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一類無包膜的單鏈線狀DNA病毒。具有安全性高、免疫原性低、宿主范圍廣、表達(dá)穩(wěn)定等特點，被視為最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一。當(dāng)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞時，兩個ITR之間的外源DNA及病毒基因組一起進入細(xì)胞，線性雙鏈DNA基因組以游離DNA的形式存在于細(xì)胞核中。其具有多種血清型，各種不同血清型的AAV載體的主要區(qū)別是衣殼蛋白不同，因此對不同的組織和細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率存在差異。值得注意的是，AAV載體的最大包裝容量僅為4.7kb，因此適用于Cas9質(zhì)粒DNA的遞送。如果需要遞送體積龐大的Cas9蛋白即RNP體系時，需要使用體積較小的SaCas9蛋白或者將遞送系統(tǒng)分割為兩個載體等。

綜合各病毒載體的特性，病毒載體較其他非病毒載體體系的優(yōu)勢在于較高的轉(zhuǎn)染效率，尤其是在原代細(xì)胞和干細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率依然可以接近100%，可廣泛適用于體內(nèi)實驗和體外實驗，具有良好的泛用性。病毒載體劣勢在于搭載的基因片段大小受限于病毒衣殼的結(jié)構(gòu)大小，大片段基因難以通過這種技術(shù)導(dǎo)入細(xì)胞，病毒包裝技術(shù)較為復(fù)雜、存在一定的生物安全問題。

通過不同的遞送方式完成CRISPR/Cas系統(tǒng)的“最后一公里”，是影響基因編輯效率的關(guān)鍵。從電穿孔脈沖參數(shù)的毫秒級優(yōu)化，到AAV衣殼的定向進化，遞送技術(shù)的創(chuàng)新正不斷拓展CRISPR的應(yīng)用疆界。希望大家能根據(jù)自身的實驗選擇合適的Cas蛋白-sgRNA的生物形式，并選擇適合的遞送技術(shù)完成基因編輯實驗。既然已經(jīng)將基因編輯系統(tǒng)遞送至細(xì)胞中啟動編輯，那么要如何檢測基因編輯后的效率呢？下期近岸蛋白將詳細(xì)解析CRISPR/Cas系統(tǒng)的編輯效率驗證技術(shù)！

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