脊椎動物胚胎軸體的形成從胚胎尾部的祖細胞群開始。其中，神經中胚層祖細胞（NMP）具備向外胚層發育為神經板及神經管，以及向中胚層發育為脊索和軸旁中胚層（PXM）等的能力。PXM隨后發育為體節（somite），體節進一步分化為生骨節、生皮節和生肌節，未來成為脊椎（圖1）[1]。神經管、脊索和體節是軀干組織的主要部分。尤其是位于胚胎中線的脊索，是軸體形成的標志性結構，為發育中的胚胎提供結構支持，并通過信號分子調控周圍組織發育。
圖1：中胚層發育模式
（來源：參考資料[1]）
盡管此前已使用干細胞開發了模擬原腸胚、體節等結構及功能的類器官，然而最關鍵的脊索及其依賴組織，如神經底板的體外模型一直未能成功構建。直至2024年12月18日，英國 Francis Crick Institute團隊在頂刊Nature上發表了題為“Timely TGFβ signalling inhibition induces notochord”的研究論文，首次通過WNT和FGF激活以及延遲24小時后的TGFβ/BMP抑制，成功誘導了脊索類器官notoroids的建立。該方法可穩健構建由體節和神經周圍組織包覆的脊索細胞，且產生的脊索類器官具有體外調控神經管及體節發育的能力。
（來源：參考資料[2]）
01 軀干組織主要祖細胞群體特征
雞胚尾部區域的scRNA-seq聚類分析揭示，在4體節到13體節的發育階段，對脊椎動物軀干形成負責的主要祖細胞群體為NMP和脊索祖細胞。其中，NMP共表達神經細胞標志物SOX2與中胚層標志物TBXT（即SOX2+TBXT+細胞）。脊索祖細胞則具有表達高水平TBXT、FOXA2、SHH等的重點特征。
以上雞胚檢測結果與小鼠和獼猴中的檢測結果幾乎相同，證明脊椎動物軀干發育存在保守性。
圖2：雞軀干發育的單細胞轉錄組學分析
（來源：參考資料[2]）
02 誘導中胚層發育和脊索形成的主要信號通路
為了測試特定信號通路在軀干祖細胞特化中的功能，研究人員建立了SOX2+TBXT+NMP的軀干祖細胞體外模型，并通過幾何限制誘導了有序的基因表達，以及脊索細胞、神經細胞等的分區排列。其中，SOX2高水平表達（SOX2hi）的類神經細胞位于克隆中心，而TBXT高水平表達（TBXThi）的類中胚層細胞位于克隆邊緣位置。
WNT及FGF共刺激
此前已有多項研究證明，FGF和WNT信號誘導中胚層發育及PXM命運。本文中，FGF通路下游配體pERK1/2激活了克隆邊緣TBXT標記的中胚層的發育，但對克隆中心SOX2標記的神經細胞影響較弱，且內源性FGF信號傳導不足以驅動PXM形成。WNT則通過激活TBXT在NMP中誘導中胚層的形成。
有趣的是，WNT也與FGF協同促進pERK1/2表達及脊索形成，而TBXT的表達也依賴于FGF信號傳導。總之，WNT和FGF關系密切，其共刺激對于脊索的形成是必要的。
圖3：WNT及FGF誘導中胚層發育
（來源：參考資料[2]）
BMP延遲抑制
通過scRNA-seq，研究人員發現，NMP具有BMP和NODAL抑制劑BAMBI的高表達。脊索細胞中，也存在高水平BMP拮抗因子NOG和CHRD的表達。跨物種轉錄組比較進一步揭示了BMP和NODAL抑制在脊索中廣泛的存在。其中，NODAL隸屬轉化生長因子β（TGFβ）信號家族。這些信息可能提示，TGFβ/BMP抑制也是脊索發育所必需。
研究人員進一步探索發現，根據TGFβ/BMP抑制的干預時間不同，可以誘導不同的細胞命運。瞬時TGFβ信號傳導（短期抑制，從添加WNT和FGF后起24h后再進行抑制），導致SOX2+TBXT+NMP顯著減少，細胞多向TBXT+FOXA2+脊索細胞命運轉變。而延長的信號傳導（長期抑制，延遲48h施加抑制）則誘導內胚層和側板中胚層的產生。
圖4：不同延遲處理下細胞類型標志物的免疫熒光。左側為從添加WNT&TFG后起算到加入TGFβ抑制的時間。
（來源：參考資料[2]）
03 脊索類器官構建方案
綜合以上研究結果，本研究采用人ES細胞，添加WNT&FGF共刺激，24h后給予TGFβ抑制，而后在添加視黃酸前體的條件下繼續培養4天，最終成功獲得脊索類器官（notoroids）。該模型內部細胞表達TBXT，指向脊索身份。外細胞層為SOX2+TBXT-，形態類似于神經上皮。脊索類器官可模擬胚胎尾部神經形成階段，為軀干組織形成及發育研究提供了良好平臺。
圖5：脊索類器官的建立與驗證
（來源：參考資料[2]）
04 引導周圍組織命運
SHH是一類形態發生素，高濃度的SHH誘導腹部神經元的形成，低濃度的SHH則誘導運動神經元等的形成。scRNA-seq結果顯示，脊索類器官產生的形態發生素SHH誘導了神經管向腹部神經元方向分化。此外，多種側腹細胞類型的基因表達皆與附近脊索樣細胞的存在相關。
新生PXM和脊索共表達BMP拮抗劑NOG和CHRD，從而保護并促進體節的形成與分化。scRNA-seq分析顯示，脊髓類器官體外發育過程中出現類似于生骨節命運的基因表達模式，再度證明了脊索類器官對周圍組織命運的調控能力。
05 總結
本文中，研究人員發現，WNT及FGF刺激以及BMP和NODAL抑制對于產生和維持軀干祖細胞和后部身份至關重要。事實上，WNT和FGF信號可誘導內源性NODAL和BMP的連續產生，以此促進內胚層和側中胚層分化，這可能是此前使用CHIR和FGF產生3D類原腸胚方案含有大量內胚層的主因。本研究中，研究人員使用信號級聯反應擴展當前早期人類發育3D模型，并獲得了可形成脊索的體外軀干組織研究新平臺，為脊椎動物軀干發育機制提供了全新見解與模型基礎。
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參考資料
1.Tani, Shoichiro et al. “Understanding paraxial mesoderm development and sclerotome specification for skeletal repair.” Experimental & molecular medicine vol. 52,8 (2020): 1166-1177. doi:10.1038/s12276-020-0482-1
2.Rito, Tiago et al. “Timely TGFβ signalling inhibition induces notochord.” Nature, 10.1038/s41586-024-08332-w. 18 Dec. 2024, doi:10.1038/s41586-024-08332-w