PCR擴增是分子生物學研究中的重要實驗內容，幾乎貫穿了所有基因相關研究的始終。然而，即便是經驗豐富的研究者，也常常會在PCR實驗中遇到各種"疑難雜癥"。本文將系統梳理PCR擴增中的異常擴增問題，并提供詳細的解決方案，幫你快速排查故障，獲得理想結果。
01 無擴增產物（假陰性結果）
電泳檢測無任何條帶。
可能原因：
1.模板出現降解或模板濃度過低：建議重新提取模板；增加DNase處理步驟；使用新鮮制備的模板。
2.模板添加量不當：通常建議梯度測試10-100ng范圍，基因組DNA通常50-200ng最佳。
3.引物出現降解：可在實驗前進行PAGE電泳驗證引物完整性；避免反復凍融（建議分裝保存）。
4.設計缺陷：使用Primer-BLAST驗證特異性，避免跨內含子設計。
5.濃度不對稱：瓊脂糖凝膠電泳檢測引物等摩爾濃度。
6.Mg2+濃度不適：可梯度測試1.5-4mM（每次增減0.5mM）。
7.退火溫度過高：以Tm值-5℃為起點進行梯度優化。
8.酶失活：新舊酶平行對照測試，注意保存條件。
02 非特異性擴增（多條帶問題）
除目的條帶外，出現位置不固定的額外條帶。
可能原因：
1.引物問題：引物與模板非特異性結合（如基因組重復序列）；引物自身二聚體/發夾結構（ΔG<-3 kcal/mol）。可重新設計引物（使用Primer-BLAST、OligoAnalyzer檢查特異性）；引物3'端避免連續G/C（防止非特異延伸）；縮短引物長度。
2.退火溫度（Tm）過低：低退火溫度會使部分匹配的引物結合。可通過梯度PCR測試最佳退火溫度（Tm+2-5℃）；使用Touchdown PCR（每循環降0.5℃，逐步篩選特異性）。
3.Mg2+濃度過高：會增強Taq酶非特異性延伸活性。可通過降低Mg2+濃度解決。
4.模板DNA污染或過量：基因組DNA污染（如RNA樣本中殘留gDNA）；模板量過高（>100 ng/μL）導致非特異性競爭結合。可使用DNase I處理RNA或使用gDNA去除試劑盒；減少模板量（如cDNA稀釋10倍后使用）。
5.循環數過多：>35循環時低豐度非特異產物累積。可嘗試優化循環數（通常25-30循環）；
使用qPCR實時監測產物量，避免過度擴增。
6.Taq酶保真度低（如普通Taq易產生錯配）：換用高保真酶或熱啟動Taq。
7.引物濃度過高：增加引物二聚體和錯配概率。可以降低引物濃度（0.1-0.5μM，通常建議0.2μM）。
03 引物二聚體形成
100bp以下的彌散條帶，電泳時前沿異常明亮
可能原因：
1.引物問題：引物3'端存在互補序列（≥2個堿基互補），引物自身形成發夾結構，GC含量過高（>60%），引物長度過短（<18bp）。可使用Primer-BLAST等軟件重新設計引物，確保3'端最后5個堿基內不超過2個互補堿基，控制GC含量在40%-60%之間，增加引物長度至18-25bp，添加3'端修飾（如磷酸化）阻斷延伸。
2.PCR反應條件不當：如退火溫度過低，Mg²?濃度過高，循環數過多等。可進行溫度梯度PCR優化最佳退火溫度，降低引物濃度至0.1-0.5μM（常規PCR）或10-50nM（qPCR），調整Mg²?濃度至1.5-3.0mM，減少循環次數（常規PCR不超過35個循環）。
模板問題：模板量過低，模板降解。可增加模板量（但不超過500ng/50μL體系），通過檢測模板完整性排查。
04 產量過低
雖有目的條帶但信號弱，難以滿足下游實驗需求。
可能原因：
1.模板量過低：增加模板數量，但建議不超過500ng/50μL，否則可能引入抑制劑。
2.循環數過低：增加循環數，每次增加2-3個循環（建議不超過40）。
3.延伸時間不夠：增加延伸時間，復雜模板按1.5-2分鐘/kb。
4.添加輔助試劑：5-10% DMSO對GC-rich模板有效。
希望這篇PCR擴增異常排查指南可以幫到你！
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