上期我們就巨噬細胞的靶向策略進行了實例分析。在免疫細胞中，T細胞充當著不可或缺的角色。它們具有特異性和記憶性，可以被激活并產(chǎn)生針對病原體或腫瘤細胞的免疫反反應(yīng)。T細胞分為多種類型，包括Th細胞、Tc細胞、Treg細胞等。它們在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著不同的作用。探究T細胞在免疫系統(tǒng)中的作用對于理解和治療與T細胞相關(guān)的疾病具有重要意義。針對T細胞的靶向策略的研究也有助于我們開發(fā)更有效的免疫治療方法。這期我們將結(jié)合實例分析T細胞在文獻中利用AAV的靶向策略。
The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adenoassociated virus gene therapy vectors in mice [1]
主要內(nèi)容
在這篇研究表明AAV通過TLR9激活小鼠漿細胞DCs，產(chǎn)生Ⅱ型FNs。在體內(nèi)，TLR9-MyD88途徑對于AAV激活CD8 T細胞以及特異性的AAV中和抗體的產(chǎn)生至關(guān)重要。研究人員還證明，TLR9依賴性激活針對AAV的適應(yīng)性免疫是由I型IFNs介導(dǎo)的，人類pDCs可以在體外被激活以誘導(dǎo)I型IFN的產(chǎn)生，這些結(jié)果都揭示了TLR9-MyD88Ⅰ型IFN途徑的重要作用，干擾這一途徑可能會改善AAV介導(dǎo)的人類基因治療的結(jié)果。
如下圖，研究人員為了確定TLR9-MyD88途徑的生物學(xué)意義，建立了一個小鼠骨骼肌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移模型。A可以看出AAV2-HA的表達是暫時的，60天完全消失。B圖展示了標準的T細胞增殖實驗分析了脾細胞的病毒特異性T細胞的激活情況。在WT小鼠中，AAV感染導(dǎo)致強大的T細胞激活，而在Tlr9-/-或Myd88-/-小鼠中，T細胞的激活被明顯削弱了。這些結(jié)果表明，TLR9-MyD88途徑是激活A(yù)AV特異性T細胞的關(guān)鍵，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因在體內(nèi)表達的損失。之后研究人員進一步對細胞毒性的CD8 T細胞對AAV2外殼的反應(yīng)進行了研究。在Tlr9-/-或Myd88-/-小鼠中，CD8+T細胞對AAV外殼的反應(yīng)對比WT都有明顯減少。這些結(jié)果都表明，完整的TLR9-MyD88途徑是必需的。
病毒產(chǎn)品 | AAV2-CMV |
實驗動物 | C57BL/6& BALB/C |
注射方式 | 腹腔注射 |
注射量 | 1×1011 vg |
An evolved AAV variant enables efficient genetic engineering of murine T cells[2]
主要內(nèi)容
該研究在AAV6的基礎(chǔ)上進化出了一種能夠高效轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠T細胞的AAV變體Ark313，并通過CRISPR全基因組篩選確定了QA2是Ark313高效轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要因素。Ark313能夠?qū)崿F(xiàn)向小鼠T細胞的高效轉(zhuǎn)基因遞送和大片段DNA的有效精確靶向整合，可用于構(gòu)建更安全更精確的CAR-T和TCR-T細胞。
利用同源定向修復(fù)（HDR）將大片段DNA精確靶向并插入到T細胞，已經(jīng)成為T細胞療法的變革性手段。使用腺相關(guān)病毒（AAV）來遞送大片段DNA模板，大大提高了基因插入的效率，但目前仍然缺少一種高效轉(zhuǎn)導(dǎo)T細胞的AAV血清型。為了實現(xiàn)在小鼠T細胞中的靶向基因敲入，研究團隊構(gòu)建了一基于在AAV6型（AAV6）的AAV衣殼庫，在此基礎(chǔ)上改造進化出了新的AAV血清型——Ark313，其在小鼠T細胞中表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。研究團隊還通過基于CRISPR的全基因組敲除篩選，確定小鼠QA淋巴細胞抗原2（QA2）是Ark313能夠高效感染的重要因素。接下來，研究團隊證明了Ark313可實現(xiàn)對小鼠T細胞高效的不整合的DNA遞送、CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因敲除，以及大片段DNA的定向整合。
更重要的是，Ark313能夠用于構(gòu)建TRAC靶向的CAR-T細胞和轉(zhuǎn)基因的TCR-T細胞。這一高效的靶向小鼠T細胞的腺相關(guān)病毒血清型為改進T細胞療法提供了巨大潛力，也為T細胞免疫學(xué)研究開辟了新的道路。
病毒產(chǎn)品 | Ark313-U6 |
注射方式 | 直接分離培養(yǎng)原代T細胞 |
注射量 | MOI=1*104 |
Optimizing rAAV6 transduction of primary T cells for the generation of anti-CD19 AAV-CAR-T cells[3]
主要內(nèi)容
rAAV是目前最廣泛使用的基因傳遞載體，其優(yōu)點是免疫原性低，幾乎沒有毒性。然而它對原代細胞的轉(zhuǎn)染效率低，特別是T淋巴細胞。在這項研究中，研究人員優(yōu)化了rAAV6轉(zhuǎn)導(dǎo)原代T細胞的方案，顯著提高了rAAV6傳遞的CAR基因的表達效率，并成功產(chǎn)生了基于rAAV6的CAR-T細胞（AAV-CAR-T）。此外本研究還表明，rAAV6有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)了用OKT3（CD3單克隆抗體）和GENISTEIN（酪氨酸蛋白酶抑制劑）刺激的T細胞?；谏鲜鰞?yōu)化的方法，用rAAV6制備的CAR-T細胞顯示出明顯的體外和體內(nèi)的抗腫瘤能力。本研究結(jié)果建立了一種高效的AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)T細胞的方法，并將為CAR-T細胞的制備提供一種替代方法。
如下圖，為了證實優(yōu)化的方法是否也能提高CAR在T細胞中的表達效率，研究人員使用攜帶CAR的rAAV6在CMV啟動子的控制下轉(zhuǎn)染Jurkat細胞。如A所示，基因改造組的CAR表達量從20%提高到了44%。原代T細胞培養(yǎng)7-10天進行細胞擴增，然后用rAAVCMV-CAR病毒進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。在MOI為5 *105時，經(jīng)過GENISTEIN處理的原代T細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率增加了23%。此外，在高濃度的OKT3（150納克/毫升）條件下，CAR的表達效率在5*105的MOI下增加了40%。
病毒產(chǎn)品 | AAV6-CMV |
實驗動物 | C57BL/6& BALB/C |
注射方式 | 腹腔注射 |
注射量 | 1×1011 vg |
拓展閱讀
AAV在免疫細胞中的靶向策略（實例分析篇之巨噬細胞）
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參考文獻…
1. Zhu, J., X. Huang, and Y. Yang, The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adeno-associated virus gene therapy vectors in mice. J Clin Invest, 2009. 119(8): p. 2388-98.
2. Nyberg, W.A., et al., An evolved AAV variant enables efficient genetic engineering of murine T cells. Cell, 2023. 186(2): p. 446-460 e19.
3. Wang, D., et al., Optimizing rAAV6 transduction of primary T cells for the generation of anti-CD19 AAV-CAR-T cells. Biomed Pharmacother, 2022. 150: p. 113027.