什么是“260/230”、“260/280”？
在“PCR”、“qPCR”、“逆轉錄”、“一代測序”、“RNA-seq”等核酸下游實驗中，似乎每一個進行過這些實驗的實驗人員對“260/230比值”“260/280比值”都有一定的概念。但不同科研者對此似乎有不同的解讀方法，每個實驗室可能都有一套流傳已久、自圓其說的比值范圍要求。
“1.8-2.0是比較好的，2.1有點偏高，有優化的建議嗎？”
“有客戶反應兩個吸光度比值偏高，達到2.1。”
“對于RNA濃度測定，那260/280的差異一般在哪里？”
基于以上疑惑，我們先來看看試劑廠家們是怎么說的。
表1. 不同試劑廠家對比值解讀
Thermo: It is important to note that the generally accepted 260/280 ratios of1.8 and 2.0 for DNA and RNA respectively, are "rules of thumb". The actual ratio will depend on the composition of the nucleic acid. The 260/230 values for “pure” nucleic acid are often higher than the respective 260/280 values. Expected 260/230 values are commonly in the range of 2.0-2.2.
NEB: In buffered solutions, pure dsDNA has an A260/A280 of 1.85–1.88 and pure RNA has a ratio of around 2.1. In buffered solutions, pure dsDNA has slightly higher A260/A230 ratios than RNA, with a value of 2.3–2.4 commonly reported for dsDNA and 2.1–2.3 for RNA. A260/A230 ratios typically produce a higher standard deviation than A260/A280 ratios and should be interpreted with care.
Qiagen: An A260/A280 ratio of 1.8–2.1 at pH 7.5 is widely accepted as indicative of highly pure RNA. Pure RNA should also yield an A260/A230 ratio of around 2 or slightly higher; however, there is no consensus on the acceptable lower limit of this ratio.
由上得知，不同試劑廠家對于比值的要求也不盡相同，都是略有差別。要解決如上問題，我們還得從源頭看看“260/230”、“260/280”到底意味著什么。
在“朗伯-比爾定律（Beer-Lambert law）”公式中，提出了吸光度值（absorbance，簡寫A）的概念，為了便于回憶，呈上公式：A=lg(1/T)=Kbc。
該公式是對下面客觀事實的總結：某一化學物質可吸收一定波長的光，并且對光的吸收度（A）與此化學物質的濃度（c）成正比。因此，可以利用吸光度的大小來測定某種物質的濃度。
某一物質在某一個特定波長下的吸光度可用An來表示。
現在我們都知道了，A260代表核酸在最高吸收峰260nm波長處的吸光度值，即260nm處的核酸最易“表現”自己，通過檢測260nm處吸收的吸光度值最可評測純化雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA樣品的濃度（見圖2）。
圖2. 核酸吸光度譜
也可以看出核酸在220-300nm光譜范圍內均可產生吸光度值，因此，核酸也有其對應的A230、A240、A280值等。
與A260類似，蛋白及其他物質各有各的吸收峰，裂解液、結合液、漂洗液、洗滌液和洗脫液中會有TRIzol、硫氰酸胍、鹽酸胍等離液鹽、SDS、Triton X-100、Tween 20等去污劑、苯酚、EDTA、乙醇、異丙醇、NaCl等物質。
A280最能反映蛋白質濃度（蛋白有多個吸收峰，A280用的較多），A230最能反映乙醇、GTC、GuHCl等的含量，A270可用于苯酚濃度。
人們發現：“pure”DNA/RNA的吸光度值是可測量的，且“A260/ A280、A260/ A230比值”具有規律（見后續比值數據）。因此，約定俗成地認為，比值在一定程度上可說明DNA、RNA的純度。測比值屬于核酸質量評估最簡單快速、經濟實惠的方法之一。
A260/ A280與A260/ A230的合理范圍
1、撇開濃度去談比值，純屬耍流氓
作為非利益方，美國NEB官方做過這樣的一個測試：“a dilution series DNA of 150ng/µl down to 1ng/µl in TE buffer was analyzed to measure concentration and purity ratios”，評估NanoDrop® One（這臺儀器是Thermo家的）測定A260/ A280與A260/ A230的準確性。
最終得出結論：當低于50ng/µl，A260/ A280、A260/ A230比值波動非常大，應謹慎對待！當高于50ng/µl，比值波動小，測定值可信賴！
表2A. 不同濃度DNA A260/ A280比值
表2B. 不同濃度DNA A260/ A230比值
2、要特別注意的提取污染物
考慮提取DNA、RNA時，洗脫液中或多或少會有提取試劑或樣本蛋白等的殘留物，這些物質在220-300nm光譜處可形成吸光度譜，可能會與核酸吸光度譜疊加或不明趨勢地形成組合吸光度譜。這造成最終DNA/RNA測定的吸光度不能真實反應比值。
圖3. 1M異硫氰酸胍鹽測定的濃度值及其A260/A280和A260/A230比值（注：異硫氰酸胍是TRIzol的主要成分）
有文獻報告，選擇性地摻入25-200mg/ml蛋白樣品到高、低濃度（25ng/µl和100ng/µl）DNA中，蛋白污染對于低濃度DNA的比值測定值影響極大。（見表3）
表3. 蛋白質污染程度對DNA比值測定的影響
3、DNA和RNA的比值
DNA中污染RNA或RNA中污染DNA，都會引起比值的偏差。這是因為，組成DNA和RNA的A/T/C/G/U 5種核苷酸本身的A260/ A280比值不均一，而紫外吸光圖譜缺乏特異性，無法有效區分DNA和RNA。所以，高AT含量和高GC含量的核酸比值可能也會有偏差。
注1：5種核苷酸溶液A260/ A280比值：G，1.15；A，4.5；C，1.51; T，1.47; U，4.00。
注2：一般認為，DNA中污染15-20%的總RNA，會造成A260/ A280升高——由1.8偏移到1.9，A260/ A230則會下降。
4、pH及鹽離子的影響
A=lg(1/T)=Kbc中明確了在一定離子濃度與pH值的溶液中測吸光度值，這說明兩者會影響吸光度值。因此，洗脫緩沖液的選擇非常重要。
酸性溶液或水溶液比弱堿性緩沖液（如Tris緩沖液，pH8.0）的A260/ A280值低0.3-0.4。并且后者測定的A260/ A230值變異度更小。
因此，核酸濃度及質量評估時，應注意核酸稀釋液和洗脫液保持一致。
5、核酸完整度的影響
RNA的糖環上比DNA糖環上多一個自由羥基，加上環境中大量的RNA酶，RNA更易出現降解的情況。RNA的完整度不建議用吸光度比值來判斷！
關注比值，更應關注下游實驗應用
A260/ A280和A260/ A230僅作為樣本質量的參考指標，比值在不在標準范圍內對下游實驗檢測或許不那么重要。
Qiagen公司提供了參考數據：
0.1mM硫氰酸胍摻入到RNA中，A260/A230會嚴重下降，但高達100mM硫氰酸胍摻入到RNA中，不影響后續的反轉錄及qPCR結果。
因此，對于核酸的比值問題，我們首先要判斷核酸混入其他物質對所要進行的下游實驗的影響，如果不影響下游實驗，大可以不必那么關注比值問題。