什么是“260/230”、“260/280”？
在“PCR”、“qPCR”、“逆轉(zhuǎn)錄”、“一代測(cè)序”、“RNA-seq”等核酸下游實(shí)驗(yàn)中，似乎每一個(gè)進(jìn)行過這些實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)人員對(duì)“260/230比值”“260/280比值”都有一定的概念。但不同科研者對(duì)此似乎有不同的解讀方法，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室可能都有一套流傳已久、自圓其說的比值范圍要求。
“1.8-2.0是比較好的，2.1有點(diǎn)偏高，有優(yōu)化的建議嗎？”
“有客戶反應(yīng)兩個(gè)吸光度比值偏高，達(dá)到2.1。”
“對(duì)于RNA濃度測(cè)定，那260/280的差異一般在哪里？”
基于以上疑惑，我們先來(lái)看看試劑廠家們是怎么說的。
表1. 不同試劑廠家對(duì)比值解讀
Thermo: It is important to note that the generally accepted 260/280 ratios of1.8 and 2.0 for DNA and RNA respectively, are "rules of thumb". The actual ratio will depend on the composition of the nucleic acid. The 260/230 values for “pure” nucleic acid are often higher than the respective 260/280 values. Expected 260/230 values are commonly in the range of 2.0-2.2.
NEB: In buffered solutions, pure dsDNA has an A260/A280 of 1.85–1.88 and pure RNA has a ratio of around 2.1. In buffered solutions, pure dsDNA has slightly higher A260/A230 ratios than RNA, with a value of 2.3–2.4 commonly reported for dsDNA and 2.1–2.3 for RNA. A260/A230 ratios typically produce a higher standard deviation than A260/A280 ratios and should be interpreted with care.
Qiagen: An A260/A280 ratio of 1.8–2.1 at pH 7.5 is widely accepted as indicative of highly pure RNA. Pure RNA should also yield an A260/A230 ratio of around 2 or slightly higher; however, there is no consensus on the acceptable lower limit of this ratio.
由上得知，不同試劑廠家對(duì)于比值的要求也不盡相同，都是略有差別。要解決如上問題，我們還得從源頭看看“260/230”、“260/280”到底意味著什么。
在“朗伯-比爾定律（Beer-Lambert law）”公式中，提出了吸光度值（absorbance，簡(jiǎn)寫A）的概念，為了便于回憶，呈上公式：A=lg(1/T)=Kbc。
該公式是對(duì)下面客觀事實(shí)的總結(jié)：某一化學(xué)物質(zhì)可吸收一定波長(zhǎng)的光，并且對(duì)光的吸收度（A）與此化學(xué)物質(zhì)的濃度（c）成正比。因此，可以利用吸光度的大小來(lái)測(cè)定某種物質(zhì)的濃度。
某一物質(zhì)在某一個(gè)特定波長(zhǎng)下的吸光度可用An來(lái)表示。
現(xiàn)在我們都知道了，A260代表核酸在最高吸收峰260nm波長(zhǎng)處的吸光度值，即260nm處的核酸最易“表現(xiàn)”自己，通過檢測(cè)260nm處吸收的吸光度值最可評(píng)測(cè)純化雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA樣品的濃度（見圖2）。
圖2. 核酸吸光度譜
也可以看出核酸在220-300nm光譜范圍內(nèi)均可產(chǎn)生吸光度值，因此，核酸也有其對(duì)應(yīng)的A230、A240、A280值等。
與A260類似，蛋白及其他物質(zhì)各有各的吸收峰，裂解液、結(jié)合液、漂洗液、洗滌液和洗脫液中會(huì)有TRIzol、硫氰酸胍、鹽酸胍等離液鹽、SDS、Triton X-100、Tween 20等去污劑、苯酚、EDTA、乙醇、異丙醇、NaCl等物質(zhì)。
A280最能反映蛋白質(zhì)濃度（蛋白有多個(gè)吸收峰，A280用的較多），A230最能反映乙醇、GTC、GuHCl等的含量，A270可用于苯酚濃度。
人們發(fā)現(xiàn)：“pure”DNA/RNA的吸光度值是可測(cè)量的，且“A260/ A280、A260/ A230比值”具有規(guī)律（見后續(xù)比值數(shù)據(jù)）。因此，約定俗成地認(rèn)為，比值在一定程度上可說明DNA、RNA的純度。測(cè)比值屬于核酸質(zhì)量評(píng)估最簡(jiǎn)單快速、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的方法之一。
A260/ A280與A260/ A230的合理范圍
1、撇開濃度去談比值，純屬耍流氓
作為非利益方，美國(guó)NEB官方做過這樣的一個(gè)測(cè)試：“a dilution series DNA of 150ng/µl down to 1ng/µl in TE buffer was analyzed to measure concentration and purity ratios”，評(píng)估NanoDrop® One（這臺(tái)儀器是Thermo家的）測(cè)定A260/ A280與A260/ A230的準(zhǔn)確性。
最終得出結(jié)論：當(dāng)?shù)陀?0ng/µl，A260/ A280、A260/ A230比值波動(dòng)非常大，應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待！當(dāng)高于50ng/µl，比值波動(dòng)小，測(cè)定值可信賴！
表2A. 不同濃度DNA A260/ A280比值
表2B. 不同濃度DNA A260/ A230比值
2、要特別注意的提取污染物
考慮提取DNA、RNA時(shí)，洗脫液中或多或少會(huì)有提取試劑或樣本蛋白等的殘留物，這些物質(zhì)在220-300nm光譜處可形成吸光度譜，可能會(huì)與核酸吸光度譜疊加或不明趨勢(shì)地形成組合吸光度譜。這造成最終DNA/RNA測(cè)定的吸光度不能真實(shí)反應(yīng)比值。
圖3. 1M異硫氰酸胍鹽測(cè)定的濃度值及其A260/A280和A260/A230比值（注：異硫氰酸胍是TRIzol的主要成分）
有文獻(xiàn)報(bào)告，選擇性地?fù)饺?5-200mg/ml蛋白樣品到高、低濃度（25ng/µl和100ng/µl）DNA中，蛋白污染對(duì)于低濃度DNA的比值測(cè)定值影響極大。（見表3）
表3. 蛋白質(zhì)污染程度對(duì)DNA比值測(cè)定的影響
3、DNA和RNA的比值
DNA中污染RNA或RNA中污染DNA，都會(huì)引起比值的偏差。這是因?yàn)?，組成DNA和RNA的A/T/C/G/U 5種核苷酸本身的A260/ A280比值不均一，而紫外吸光圖譜缺乏特異性，無(wú)法有效區(qū)分DNA和RNA。所以，高AT含量和高GC含量的核酸比值可能也會(huì)有偏差。
注1：5種核苷酸溶液A260/ A280比值：G，1.15；A，4.5；C，1.51; T，1.47; U，4.00。
注2：一般認(rèn)為，DNA中污染15-20%的總RNA，會(huì)造成A260/ A280升高——由1.8偏移到1.9，A260/ A230則會(huì)下降。
4、pH及鹽離子的影響
A=lg(1/T)=Kbc中明確了在一定離子濃度與pH值的溶液中測(cè)吸光度值，這說明兩者會(huì)影響吸光度值。因此，洗脫緩沖液的選擇非常重要。
酸性溶液或水溶液比弱堿性緩沖液（如Tris緩沖液，pH8.0）的A260/ A280值低0.3-0.4。并且后者測(cè)定的A260/ A230值變異度更小。
因此，核酸濃度及質(zhì)量評(píng)估時(shí)，應(yīng)注意核酸稀釋液和洗脫液保持一致。
5、核酸完整度的影響
RNA的糖環(huán)上比DNA糖環(huán)上多一個(gè)自由羥基，加上環(huán)境中大量的RNA酶，RNA更易出現(xiàn)降解的情況。RNA的完整度不建議用吸光度比值來(lái)判斷！
關(guān)注比值，更應(yīng)關(guān)注下游實(shí)驗(yàn)應(yīng)用
A260/ A280和A260/ A230僅作為樣本質(zhì)量的參考指標(biāo)，比值在不在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)對(duì)下游實(shí)驗(yàn)檢測(cè)或許不那么重要。
Qiagen公司提供了參考數(shù)據(jù)：
0.1mM硫氰酸胍摻入到RNA中，A260/A230會(huì)嚴(yán)重下降，但高達(dá)100mM硫氰酸胍摻入到RNA中，不影響后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄及qPCR結(jié)果。
因此，對(duì)于核酸的比值問題，我們首先要判斷核酸混入其他物質(zhì)對(duì)所要進(jìn)行的下游實(shí)驗(yàn)的影響，如果不影響下游實(shí)驗(yàn)，大可以不必那么關(guān)注比值問題。