細胞外基質硬化是軟骨老化的典型特征，是導致膝骨關節炎（KOA）的主要原因。然而，與年齡相關的生物物理改變的下游分子和細胞特征尚不清楚。
2023年1月，美國科學家通過對不同年齡和性別的小鼠的膝關節軟骨進行形態學檢測和蛋白質組學檢測，通過分析鎖定了一個蛋白α-Klotho，該蛋白在調控膝關節軟骨退化中發揮重要作用，并深入挖掘了相關機制。研究成果以“Age-related matrix stiffening epigenetically regulates α-Klotho expression and compromises chondrocyte integrity”為題，發表在Nature Communications（IF：17.694 ）上。
研究結果
1. 衰老引起的軟骨退化
作者設置了3個年齡段的雌性和雄性小鼠組別，分別是年輕組（4-6個月齡）、中年組（10-14月齡）和老年組（18-24月齡），分別對應人的20-30歲、38-47歲以及56-69歲，并對這6個組別的小鼠脛骨內側軟骨完整性進行了檢測（脛骨內側軟骨是最受膝關節炎影響的區域）。檢測結果顯示，軟骨退化從中年開始，這與人類臨床相關報道一致。軟骨表面的粗糙程度也隨著年齡增大而增加。有趣的是，軟骨退化程度和表面粗糙程度在雄性小鼠上比雌性小鼠更明顯。
2. 蛋白質組學揭示與年齡和性別依賴的軟骨退化相關的信號通路
隨后，作者對不同性別的各3個年齡段小鼠的關節軟骨進行了基于質譜的蛋白質組學檢測（共6個組別，每個組別5個生物學重復）。蛋白質組學共檢測到了6694個蛋白。與組織學觀察的結果相似，和雌性小鼠相比，雄性小鼠隨著時間的推移在單個蛋白質表達上呈現出更多的變化。不同性別的年老與年輕組間差異蛋白的KEGG富集分析顯示，在雌性小鼠中，有兩種通路顯著富集，而在雄性小鼠中，有八種通路顯著富集。在這些通路中，只有PI3K/Akt信號通路是隨著時間在中年就發生改變的。總體來說，作者的結果和此前人關節炎的研究報道類似，PI3K/Akt信號通路發生擾動。GO富集分析結果顯示，隨著年齡增長上調的蛋白富集在代謝應激、機械轉導（mechanotransduction）和凋亡，而下調蛋白富集在基質組織、細胞增殖和蛋白代謝。
3. α-Klotho敲低驅動雄性小鼠的軟骨退化
緊接著，作者挖掘潛在的調控蛋白。IPA分析（Ingenuity pathway analysis）發現激活的INS/INSR信號可能是個重要的調控因子。INS/INSR信號是PI3K/Akt信號的上游信號。因此，作者尋找可以抑制INS/INSR/PI3K軸的調控因子。其中一個關鍵調控因子就是長壽蛋白α-Klotho。作者分析了一個公開的基因芯片數據，發現在原代軟骨細胞中抑制α-Klotho能顯著激活PI3K/Akt信號。同時，α-Klotho過表達已被發現在PTOA（創傷性骨關節炎）模型中延緩軟骨退化，但α-Klotho是否在衰老相關的KOA（膝關節炎）模型中發揮作用并未被充分研究。因此，作者鎖定α-Klotho進行后續研究。
作者檢測了小鼠和人軟骨中α-Klotho的表達，發現α-Klotho的表達量均隨著年齡增長而降低，且與男性中更嚴重的軟骨退化相關。
為了直接評估α-Klotho對軟骨健康的影響，作者檢測了Klotho雜合缺失（Klotho+/-）小鼠模型中的軟骨情況。結果發現，雜合性缺失的年輕和中年雄性小鼠存在加速的軟骨退化，而在雌性Klotho+/-小鼠中，并未觀察到加速的軟骨退化。鑒于這種性別間的差異，作者認為α-Klotho或許是一個性別依賴的、衰老相關膝關節炎的驅動因子?？紤]到在雌性小鼠上只呈現了有限的疾病表型，作者只使用雄性小鼠進行后續研究。
4. 年齡相關的α-Klotho減少與小鼠和人軟骨細胞的細胞核機械力學相關
前面蛋白質組學的結果顯示，在年老的小鼠軟骨中機械轉導信號發生擾動。這促使作者思考衰老相關的α-Klotho減少是不是微環境中改變的機械信號導致的結果。
衰老與細胞核機械力學以及核被膜功能障礙的進行性改變相關，這將驅動染色質重塑和基因表達改變。核被膜主要由核纖層（比如，lamin A/C和lamin B）和一個雙層膜通過核骨架和細胞骨架復合物的連接組成。特別的是，lamin A/C是一個已知的細胞核完整性調節因子。作者回溯蛋白質組學結果發現，與年輕小鼠相比，年老小鼠的纖層蛋白laminA/C和B2的蛋白質豐度顯著增加。
為了進一步表征年齡相關的核被膜變化，作者量化了軟骨組織中的軟骨細胞核形態，包括大小、形狀、強度和結構。53個形態學變量的主成分分析(PCA)顯示年輕和年老軟骨細胞的細胞核明顯分離。
在影響第一主成分的前10個變量中，核離心率（eccentricity）或球形度被發現是小鼠和人類樣本中與衰老相關的高度敏感的核形態標志物。值得注意的是，核離心率（eccentricity）的增加(即球形核的減少)也與α-Klotho蛋白水平的降低顯著相關。這些結果表明α-Klotho水平的下降可能歸因于細胞核機械力學的改變。
5. 基質硬度上升誘導α-Klotho減少并導致年輕軟骨細胞產生一種衰老的表型
細胞核與微環境機械力學關聯，在微環境中，細胞骨架元件會根據外部ECM硬度情況調節細胞核形狀。于是，作者進一步研究ECM硬度上升對軟骨細胞表型的直接影響。作者將原代軟骨細胞“種植”在不同硬度（5kPa、21kPa和100kPa）的聚丙烯酰胺（polyacrylamide，pAAm）凝膠上。與生長在較軟基質上的細胞相比，生長在較硬基質上的年輕軟骨細胞呈現一種年老的表型，II型膠原蛋白和聚蛋白多糖表達下調，同時伴隨著α-Klotho的表達下調。而生長在較軟基質上的年老軟骨細胞中，以上幾個蛋白的表達則上調。
為了檢測基質硬度是否直接通過α-Klotho調控軟骨形成，作者對生長在軟基質上的年輕軟骨細胞進行敲低。結果發現，siRNA導致的α-Klotho敲低產生的影響超過了軟基質的促軟骨形成能力，表現為II型膠原蛋白和聚蛋白多糖的下調。
作者繼續在3D微環境驗證上述現象是否依然存在。結果顯示，和2D的生長環境一致，在3D微環境下，年輕軟骨細胞在一個硬的3D微環境中也出現了下調的α-Klotho和II型膠原蛋白。總體，2D和3D的結果表明，軟的基質能促進年老軟骨細胞有一種更年輕的表型，而硬的基質則會加速時間對年輕軟骨細胞的影響。
6. 基質硬度通過表觀調控α-Klotho的表達
已知機械力誘導核染色體結構調節和表觀特征來調控基因轉錄。因此，研究者檢測硬的基質導致的α-Klotho缺失是否是由表觀修飾介導的。作者檢測了在不同硬度基質上生長的年輕或年老的軟骨細胞中Klotho基因啟動子區的甲基化。結果顯示，硬的基質條件下，年輕軟骨細胞Klotho基因啟動子甲基化增加，α-Klotho表達下調。相反地，軟的基質顯著降低Klotho基因啟動子甲基化，上調α-Klotho表達。此外，在軟的基質促進了年輕和年老軟骨細胞的總體DNA甲基化，程度相比Klotho基因啟動子甲基化要低。硬度依賴的Klotho基因啟動子甲基化也被隨著基質硬度升高軟骨細胞中升高的DNA甲基轉移酶DNMT1表達所印證。
隨后，作者通過ChIP實驗確認ECM（細胞外基質）硬度增加與上升的DNMT1和Klotho基因啟動子結合有關。同時，作者檢測到Klotho基因轉錄減弱。另一個ChIP實驗明確了硬的基質是通過在DNMT1啟動子區招募Pol II、H3K4M2，而非H3K9M2，最終引起DNMT1表達上調。同時，還發現了c-MYC與DNMT1啟動子的結合。C-MYC是個轉錄因子，受到激酶信號刺激或調控。總體這些發現表明，DNMT1是與硬度介導的信號直接相關的基因。
作者通過siRNA敲低DNMT1的表達，DNMT1被抑制后，硬的基質對軟骨細胞中α-Klotho的表達和軟骨生成的下調作用被挽救。此外，作者還確認了，硬的基質介導的軟骨生成下降是通過抑制Klotho實現的。
由于來自微環境的外部機械信號通過肌動蛋白細胞骨架傳遞到細胞核，作者接下來檢測細胞骨架的破壞是否抑制硬的基質對下游軟骨細胞反應的影響。作者使用肌動蛋白聚合抑制劑lat A處理在硬的基質上培養的老化細胞。lat A消除了應力纖維的形成，降低了核離心率(即增加了細胞核圓度)，并降低了lamin A/C的表達，而不影響軟骨細胞的活力。肌動蛋白聚合的減少降低了DNMT1的表達，增加了α-Klotho水平，最終恢復了II型膠原蛋白和聚蛋白多糖水平。
lat A處理后α-Klotho水平的增加也伴隨著Klotho啟動子甲基化水平的降低，但全局DNA甲基化沒有顯著改變。有趣的是，硬的基質引起的Dnmt1啟動子上Pol II和c-MYC結合的增加在lat A處理條件下被消除。因此，作者認為Klotho/Dnmt1的轉錄機制可能受到機械信號的表觀遺傳調控。當細胞在硬的基質上培養時，lat A處理也消除了Pol II、H3K4M2和DNMT1在Klotho啟動子處結合的變化。使用肌動蛋白纖維形成的抑制劑Y-27632或粘附斑激酶抑制劑PF-562271同樣消除了生長在硬的基質上的軟骨細胞中DNMT1的增加和α-Klotho的減少。
7. 降低ECM硬度可增加α-Klotho的表達并改善衰老小鼠的軟骨健康
前述結果提高了通過阻止或者反轉基質變硬的靶向ECM機械力學策略來治療衰老相關膝關節炎的可能性。作者回看了蛋白質組學的結果，發現基于155個ECM蛋白的PCA分析結果中，年老軟骨的ECM相關蛋白的表達譜發生了改變。賴氨酰氧化酶(LOX)出現在對PC2有貢獻的前20個蛋白質中，并與纖層蛋白lamin A/C正相關?？紤]到LOX是參與膠原交聯的主要酶之一，并已被證明通過增加ECM硬度來促進PTOA（創傷性骨關節炎），因此LOX引起了作者的興趣。
隨著年齡增長，軟骨硬度增加2-3倍。作者檢測是否可通過降低年老小鼠的軟骨硬度來改善α-Klotho水平和軟骨完整性。作者使用已知的LOX抑制劑β-氨基丙/*(BAPN)降低年老小鼠軟骨硬度。連續四周每天注射BAPN可顯著降低脛骨內側軟骨的硬度。組織學分析表明，使用BAPN治療的年老小鼠的軟骨細胞顯示出與年輕小鼠類似的更球形的細胞核形態。PCA分析進一步證實，經BAPN處理的年老小鼠的軟骨細胞表現出更年輕的表型。此外，與體外研究結果一致，在體內降低年老軟骨的基質硬度可顯著提高α-Klotho水平并改善軟骨完整性。然而，在Klotho+/?小鼠中未觀察到BAPN對軟骨完整性的有益影響，說明注射BAPN后軟骨完整性的改善至少部分是由增加α-Klotho水平所驅動的。
研究總結
作者通過觀測不同年齡段小鼠軟骨情況發現，隨著年齡增大，軟骨退化程度和表面粗糙程度增加。通過蛋白質組學找到了隨著年齡增長顯著擾動的PI3K/Akt信號通路，并通過分析鎖定了一個調控因子α-Klotho。隨著年齡增大，α-Klotho蛋白表達下降，且α-Klotho雜合性缺失會加速雄性小鼠的軟骨退化。作者進一步發現，衰老誘導的α-Klotho下降與細胞核機械力學相關，進而關聯到細胞外基質。深入的機制探索發現，基質硬度的增加驅動了Klotho啟動子甲基化，下調Klotho基因表達，并加速體外軟骨細胞衰老。而將老化的軟骨細胞暴露在柔軟的基質中，則能恢復更年輕表型，并增強體內軟骨的完整性。作者的研究結果表明，與年齡相關的細胞外基質生物物理特性的改變啟動了致病的機械傳導信號，促進Klotho啟動子甲基化并損害細胞健康。作者的發現可能會超出軟骨領域，對衰老研究領域也產生影響。
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