研究背景
脊髓在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中負(fù)責(zé)大腦和機(jī)體各器官之間神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)，而撞擊、跌落等因素引起的脊髓損傷（SCI）可導(dǎo)致器官功能失常、癱瘓甚至死亡，且伴隨大量生理性和心理性的并發(fā)癥。SCI病情復(fù)雜，預(yù)后較差，且臨床上缺乏有效的治療手段。在損傷后，SCI的病理進(jìn)程可分為急性期和慢性期。其中，在急性期，脊髓損傷部位發(fā)生組織壞死、水腫、出血，并快速募集炎癥細(xì)胞，大量釋放炎癥因子和活性氧，造成惡劣的炎癥微環(huán)境，進(jìn)而導(dǎo)致脊髓二次損傷，擴(kuò)大損傷區(qū)域和加劇損傷程度。而在慢性期，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠細(xì)胞等逐漸形成致密的膠質(zhì)瘢痕，再加上人體神經(jīng)有限的再生能力，脊髓神經(jīng)無法再生和重塑，導(dǎo)致機(jī)體功能恢復(fù)不佳。因此，根據(jù)SCI在急性期和慢性期的不同特點(diǎn)，對(duì)其實(shí)行雙時(shí)期的調(diào)控具有重要意義。
2023年3月2日，浙江大學(xué)藥學(xué)院高建青教授團(tuán)隊(duì)在Chemical Engineering Journal上發(fā)表題為ROS filter coating scaffold protects 3D mesenchymal stem cell spheroids for dual-phase treatment of spinal cord injury的研究。該研究構(gòu)建了一種ROS濾網(wǎng)包裹的雙層凝膠體系攜載3D間充質(zhì)干細(xì)胞球（RF-pGel-MS）用于SCI的雙時(shí)期調(diào)控，并在SCI大鼠模型上獲得較好的運(yùn)動(dòng)學(xué)和組織學(xué)恢復(fù)。
研究內(nèi)容
1. RF-pGel-MS的構(gòu)建和表征
為了構(gòu)建RF-pGel-MS，本研究首先通過合成兩端連接ROS響應(yīng)的苯硼酸基團(tuán)的化合物TPA，并與聚乙烯醇（PVA）發(fā)生交聯(lián)即可得到具有ROS清除能力的ROS濾網(wǎng)，RF；將多孔GelMA溶液進(jìn)行紫外交聯(lián)即可得到具有疏松多孔結(jié)構(gòu)，并可攜載MSC細(xì)胞球（MS）的凝膠，pGel；通過低粘附培養(yǎng)法對(duì)MSC三維培養(yǎng)即可得到球狀的MS。最后，將MS通過共交聯(lián)的方式攜載入pGel中。RF包裹在pGel-MS的外圍即可得到最終的RF-pGel-MS。掃描電鏡顯示，RF呈現(xiàn)致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。內(nèi)部的pGel則呈現(xiàn)疏松多孔的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞在里面的存活。而MS則呈現(xiàn)致密的球形結(jié)構(gòu)，表面可見規(guī)則排列的MSC。
2. MS旁分泌效應(yīng)和神經(jīng)滋養(yǎng)能力考察
ELISA檢測細(xì)胞分泌水平以及PC12分化實(shí)驗(yàn)表明，MS相比同等細(xì)胞數(shù)量的MSC，具備更強(qiáng)的旁分泌功能，可分泌更高水平的血管生長因子（VEGF）、神經(jīng)生長因子（NGF）和膠質(zhì)來源神經(jīng)滋養(yǎng)因子（GDNF），且能更加顯著地促進(jìn)PC12類神經(jīng)細(xì)胞的分化和軸突的延伸。這得益于MS的三維空間結(jié)構(gòu)，可更好地?cái)M合MSC的體內(nèi)狀態(tài)和活性。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)不同尺寸的MS的旁分泌水平和神經(jīng)滋養(yǎng)也存在一定的不同，相比之下，尺寸較小的MS2和MS3表現(xiàn)更佳。
3. RF-pGel-MS抗ROS能力考察
在體外實(shí)驗(yàn)中，外層的RF可快速清除過氧化氫，并以ROS響應(yīng)性的方式降解。RF不僅有效保護(hù)PC12細(xì)胞，降低其胞內(nèi)ROS水平，還可保護(hù)內(nèi)部攜載的MS免受過氧化損傷。通過完全切斷脊髓的方式成功在SD大鼠上建立SCI模型。通過局部埋置的方式將RF-pGel-MS植入到損傷處進(jìn)行體內(nèi)考察。在急性期，RF-pGel-MS可顯著降低脊髓組織中DNA和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物4-HNE、8-OHdG的水平。另外，本研究采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方式使MSC表達(dá)GFP，并將得到的GFP-MSC用于MS的體內(nèi)示蹤。結(jié)果表明，MS在RF的保護(hù)下，在植入體內(nèi)后第4天仍可保持完整的形態(tài)。
4. RF-pGel-MS長期療效考察
將RF-pGel-MS植入到SCI大鼠中，考察大鼠術(shù)后5周的功能學(xué)和組織學(xué)恢復(fù)。各組模型大鼠在術(shù)后第1周均有體重下降現(xiàn)象，但在后續(xù)總體保持平穩(wěn)，說明植入的凝膠體系無明顯的毒性。BBB評(píng)分結(jié)果表明，各組大鼠在術(shù)后5周均有一定的恢復(fù)。而RF-pGel-MS可明顯改善SCI大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)能力，該組大鼠可觀察到大幅的踝關(guān)節(jié)活動(dòng)，偶見負(fù)重行走動(dòng)作。在第5周，本研究在大鼠后肢植入電極，并使用金屬點(diǎn)對(duì)后肢各關(guān)節(jié)進(jìn)行標(biāo)記，在Vicon成像系統(tǒng)的幫助下可直觀地觀察到大鼠后肢運(yùn)動(dòng)過程中各關(guān)節(jié)高度和角度變化以及腿部肌肉肌電信號(hào)變化。結(jié)果表明，經(jīng)RF-pGel-MS治療后，大鼠后肢運(yùn)動(dòng)具有更大幅度的關(guān)節(jié)角度和高度變化，肌電信號(hào)在頻率和幅度上也顯著提升。最后，組織學(xué)考察表明，RF-pGel-MS可促進(jìn)神經(jīng)的再生和神經(jīng)纖維的延伸。
研究總結(jié)
1. 針對(duì)SCI急性期和慢性期不同特點(diǎn)和需求，構(gòu)建了一種集ROS清除、干細(xì)胞療法為一體的雙層凝膠體系，RF-pGel-MS。
2. RF可快速清除ROS，降低組織的過氧化損傷和減緩二次損傷，并保護(hù)支架體系的MS，提高其植入后的生存率。
3. 具有3D結(jié)構(gòu)的MS可擬合MSC的體內(nèi)狀態(tài)，相比2D結(jié)構(gòu)的MSC具有更強(qiáng)的旁分泌效應(yīng)和神經(jīng)滋養(yǎng)效果。
綜上所述，該雙層凝膠體系有望為SCI雙時(shí)期調(diào)控治療提供新的思路。
吉?jiǎng)P助力
本研究采用了吉?jiǎng)P基因公司GFP-轉(zhuǎn)染慢病毒產(chǎn)品用于MSC的熒光標(biāo)記，助力高水平的科學(xué)研究。經(jīng)過慢病毒轉(zhuǎn)染和嘌呤霉素篩選的GFP-MSC可持續(xù)擴(kuò)增并穩(wěn)定表達(dá)GFP熒光。
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作者簡介
本研究第一作者為浙江大學(xué)藥學(xué)院博士研究生曹堅(jiān)和吳佳禾博士后，通訊作者為浙江大學(xué)藥學(xué)院高建青教授和天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院馮世慶教授。