病毒污染是使用源自哺乳動物細胞系的生物技術產(chǎn)品的潛在風險。生產(chǎn)過程中，無論處于臨床前非GMP、臨床GMP或商業(yè)化階段，均可能受到內(nèi)源性或外源性病毒的污染，對患者安全構(gòu)成嚴重威脅。據(jù)統(tǒng)計，過去36年間共報告了26起哺乳動物細胞培養(yǎng)物的病毒污染事件，其發(fā)生在產(chǎn)品生命周期的所有階段。因此，確保產(chǎn)品病毒安全性是行業(yè)監(jiān)管與工藝開發(fā)的核心關注點。
為了保證這些產(chǎn)品在潛在病毒污染方面的安全性，監(jiān)管機構(gòu)要求進行病毒清除研究，以評估純化過程清除內(nèi)源性和外源性病毒的能力。一般來說，下游工藝減少病毒是通過柱層析和專用的病毒去除步驟（即低pH值孵育、去污劑處理和納濾）來實現(xiàn)的。本文將簡述陰離子層析（Anion exchange chromatography, AEX）病毒去除效果及影響因素。
AEX病毒去除機理與能力
在下游純化工藝中，層析步驟除有效去除工藝相關雜質(zhì)和產(chǎn)品相關雜質(zhì)外，亦是重要的病毒清除單元操作。其中，AEX常被證明是病毒清除最為關鍵的步驟。
AEX病毒去除機理
AEX用于抗體類項目純化時，主要采用兩種模式：
• 流穿模式 (Flow Through Mode, FT)：此模式利用目標單抗與模型病毒等電點（pI）的差異。多數(shù)單抗pI較高，在適宜的緩沖液條件下（pH 7.0~8.5，低電導率），單抗因帶正電荷而流穿；而模型病毒（如X-MuLV pI~5.8, MVM pI~6.2）在此條件下帶負電荷，通過與填料帶正電荷的配基發(fā)生靜電吸附而被去除。
• 結(jié)合-洗脫模式 (Bind and Elute Mode, B/E)：此模式則利用單抗與病毒在結(jié)合力強度上的差異。在特定條件下，單抗和病毒均結(jié)合至填料上，隨后通過改變洗脫條件，選擇性地洗脫單抗，而病毒仍保留在填料上。
AEX色譜病毒去除能力
大量數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)T模式AEX能有效去除包膜病毒和非包膜病毒，統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明（如Fig.1）：
• 約70%的AEX應用采用FT模式，約30%采用B/E模式。
• FT模式對兩種病毒表現(xiàn)出較高的穩(wěn)健性，且批次間變異性較低。
• B/E模式對兩種病毒的清除能力呈現(xiàn)更高的批次間變異性。
• 兩種模式下細小病毒批次間變異性均大于逆轉(zhuǎn)錄病毒。
Fig.1 陰離子交換層析對逆轉(zhuǎn)錄病毒和細小病毒的去除能力總結(jié)（FDA數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計）
復合模式陰離子層析病毒去除能力
復合模式層析填料同時具有離子交換與疏水相互作用等多種作用力，這種多模式機制賦予了其獨特的優(yōu)勢：
• 增強緩沖液的兼容性：可在更寬的pH值和電導率范圍內(nèi)有效運行。
• 更穩(wěn)健的病毒清除：如Fig.2所示，與單一模式AEX相比，復合模式AEX在高鹽條件下仍能維持優(yōu)異的細小病毒去除效能（在高鹽區(qū)仍保持較高LRV）。
Fig.2 復合模式陰離子層析 vs. 單一陰離子層析對細小病毒的去除能力比較（FDA數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計）
AEX病毒去除能力的關鍵影響因素
病毒-介質(zhì)相互作用強度可能受到病毒等電點（pI）與溶液pH值、溶液鹽濃度、Mab性質(zhì)、病毒上可用結(jié)合位點的數(shù)量以及競爭物存在等因素相互作用的的影響。
• pH值：病毒-AEX的相互作用為靜電，但在低鹽條件下，X-MuLV在不同pH下清除效果比較穩(wěn)定，X-MuLV和AEX填料之間的相互作用在5.0~8.0的范圍內(nèi)僅略微依賴于pH值。與X-MuLV 清除率不同，不同pH值的MVM(pI 6.2)去除符合預期，當50 mM氯化鈉的pH值從5增加到8時，LRV大約增加4。
• 離子強度：對于單一的陰離子層析，通常隨著鹽濃度增加，病毒去除效果逐漸降低。而復合模式層析受鹽濃度影響較小，由Fig.2可知。
• Mab性質(zhì)：對于任何給定類型的色譜分析，特定病毒的清除率不僅受色譜形成條件的影響，還受目標mAb本身的影響，病毒可以通過其表面負電荷與帶正電荷的mAb相互作用，從而影響病毒的去除效果。
• 病毒種類：X-MuLV的pI為5.8，該現(xiàn)象（X-MuLV在pH值為5時與AEX介質(zhì)結(jié)合）是不正常的，表明該病毒在該pH值時其表面仍舊含有帶負電荷的斑塊?？芍猵I是預測病毒等大型復雜結(jié)構(gòu)與離子交換（IEX）填料相互作用是不足的。相反，在確定病毒-IEX 填料相互作用方面，病毒表面電荷分布比 pI 更相關。
綜上可知，陰離子層析對病毒的去除效果受到多種因素影響，因此為獲得穩(wěn)健的病毒清除效果，單一模式陰離子層析建議pH 值為7.0~8.5、電導率<10 mS/cm和載量<100 mg/ml。
博格隆陰離子填料病毒去除能力數(shù)據(jù)
復合模式陰離子填料 Diamond MIX-A
• 高效清除能力：在某項目中，針對多種包膜和非包膜病毒模型（X-Mulv, MVM, PRV, Reo3）Diamond MIX-A展現(xiàn)出優(yōu)異的清除能力，LRV范圍達4.5-5.34 log。
• 卓越耐鹽性：在極具挑戰(zhàn)性的高鹽條件下（上樣電導22 mS/cm, pH 6.43, 載量~60 mg/mL），保留時間（5 min），Diamond MIX-A對X-Mulv仍實現(xiàn)了顯著的清除效果，LRV分別達到3.04 log、3.25 log，驗證了其在高鹽環(huán)境下的穩(wěn)健性。
強陰離子交換填料Diamond Q系列
下表匯總了Diamond Q系列填料在多個單抗項目中對模型病毒X-MuLV和MVM的清除表現(xiàn)：
• Diamond Q對逆轉(zhuǎn)錄病毒X-MuLV展現(xiàn)出高度一致且優(yōu)異的清除能力（所有項目LRV≥4 log）。
• 對細小病毒MVM的清除能力存在一定的項目間變異性（LRV范圍從2~5 log），這也印證了前文所述。盡管如此，在多數(shù)項目中仍能達到≥3 log的有效清除。
• Diamond Q Mustang 在測試項目中同樣表現(xiàn)出良好的病毒清除能力。
總結(jié)
下游純化工藝中各層析步驟在病毒清除方面具有不同的能力和穩(wěn)健性水平。陰離子交換層析（AEX），尤其是流穿模式（FT），已被廣泛證明是清除病毒的關鍵單元操作。
然而，即使是通常被認為穩(wěn)健的AEX步驟，其清除效果（特別是對細小病毒）也可能因目標Mab的特異性、工藝參數(shù)的選擇而存在差異。復合模式AEX填料（如Diamond MIX-A）因其結(jié)合了多種作用力，在高鹽條件下展現(xiàn)出更穩(wěn)健的病毒清除性能。
為確保病毒清除的穩(wěn)健性，需在經(jīng)過驗證的操作參數(shù)范圍內(nèi)運行AEX。病毒清除研究應使用代表性的模型病毒，并在工藝最差條件的情況下進行，以充分證明該步驟在各種潛在風險場景下均能提供可靠且符合監(jiān)管要求的病毒去除能力。
參考文獻
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關于博格隆
博格隆成立于2008年，是一家專注于為分離純化提供高質(zhì)量層析介質(zhì)的高新技術企業(yè)，是中國較早具備大規(guī)模生產(chǎn)分離純化介質(zhì)能力的企業(yè)之一。博格隆所提供的產(chǎn)品涵蓋各類分離純化介質(zhì)、預裝柱、實驗室及工業(yè)生產(chǎn)級空柱、微載體，同時提供分離純化工藝開發(fā)服務及填料定制。