疏水作用層析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC） 是蛋白質(zhì)純化技術(shù)體系中極具價(jià)值的一種分離手段。早在 1948 年，Tiselius 就提出了利用疏水相互作用進(jìn)行分離的概念。與依賴分子電荷差異的離子交換層析不同，疏水層析利用蛋白質(zhì)表面疏水結(jié)構(gòu)差異實(shí)現(xiàn)分離——在高鹽環(huán)境中，疏水基團(tuán)之間的相互作用被增強(qiáng)，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)與填料表面的結(jié)合。
在重組蛋白生產(chǎn)中，宿主細(xì)胞蛋白等雜質(zhì)通常親水性更強(qiáng)，而目標(biāo)蛋白可能含有天然疏水結(jié)構(gòu)域（如抗體的恒定區(qū)）。這種物性差異賦予疏水層析在去除特定雜質(zhì)方面的天然優(yōu)勢(shì)。更重要的是，HIC 在工藝流程中的應(yīng)用十分靈活——既可在高鹽條件下作為捕獲步驟，也可在中鹽條件下作為中度純化，也常用于在緩沖液條件稍作調(diào)整后與離子交換層析組合，實(shí)現(xiàn)精純目的。
疏水作用層析的基本純化模式
疏水作用層析常見(jiàn)的操作模式包括結(jié)合–洗脫模式和流穿模式。
• 結(jié)合–洗脫模式：工藝步驟通常包括平衡、上樣、清洗、洗脫和再生。一般在高鹽條件下將樣品上柱，高鹽環(huán)境可增強(qiáng)蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)與填料的相互作用，使目標(biāo)分子結(jié)合在介質(zhì)上。上樣及清洗后，通過(guò)逐步降低洗脫液中的鹽濃度，依結(jié)合力強(qiáng)弱依次洗脫不同分子，從而實(shí)現(xiàn)分離純化。
• 流穿模式：選擇疏水性較強(qiáng)的填料，并在上樣時(shí)不添加鹽或僅添加低濃度鹽，使目標(biāo)蛋白與填料幾乎不發(fā)生疏水作用，直接流出，而疏水性較強(qiáng)的雜質(zhì)被填料保留，實(shí)現(xiàn)雜質(zhì)去除。
疏水填料配基種類及其強(qiáng)弱應(yīng)用介紹
Table 1. 疏水填料強(qiáng)弱應(yīng)用介紹
疏水層析介質(zhì)疏水性強(qiáng)弱對(duì)比表
注：填料的疏水性不僅取決于配基種類，還會(huì)受到配基密度及基質(zhì)性質(zhì)等因素的影響，從而改變其實(shí)際疏水強(qiáng)度。
重組蛋白純化中使用疏水作用層析（HIC）的核心優(yōu)勢(shì)
獨(dú)特機(jī)制帶來(lái)的選擇性
• 基于疏水表面差異的分離：在高鹽（如 1.0~2.0M硫酸銨等鹽）條件下，疏水基團(tuán)的溶劑化被削弱，蛋白更傾向與填料的疏水配基（苯基、丁基、辛基等）發(fā)生可逆結(jié)合；隨后通過(guò)降低鹽濃度（或加入溫和添加劑）使蛋白依結(jié)合強(qiáng)弱順序洗脫。
• 可有效區(qū)分電荷相近但疏水性不同的分子：（例如與目標(biāo)蛋白等電點(diǎn)接近的 HCP）。這點(diǎn)與依賴電荷差異的離子交換形成互補(bǔ)。
• 溫和洗脫，保留活性：通過(guò)降鹽梯度洗脫，無(wú)需極端pH或高比例有機(jī)相（對(duì)比：RPC需高濃度有機(jī)試劑），最大限度保留蛋白天然構(gòu)象和生物活性。
關(guān)鍵應(yīng)用優(yōu)勢(shì)
• 特定雜質(zhì)的高效去除
○ 宿主蛋白（HCP）：疏水性較強(qiáng)者在高鹽下結(jié)合更緊，可被選擇性去除。
○ 聚集體：因疏水表面積更大，優(yōu)先被吸附，洗脫晚于單體，有助于樣品聚體含量控制。
○ 內(nèi)毒素與核酸：在合適鹽種類與緩沖條件下，HIC可一定程度降低其共洗脫，但通常需與AEX流穿/TFF聯(lián)合使用以達(dá)到去除標(biāo)準(zhǔn)。
• 良好的工藝銜接與通量
○ 與離子交換/鹽析無(wú)縫銜接：高鹽樣品或經(jīng)硫酸銨沉淀處理后的樣品，可在調(diào)至目標(biāo)鹽濃度且樣品澄清（0.22μm過(guò)濾）的前提下直接上柱，減少脫鹽/換液環(huán)節(jié)（是否免TFF視黏度/導(dǎo)電度窗口而定）。
○ 高通量友好：高剛性疏水填料（如Diamond Phenyl）具有良好的機(jī)械強(qiáng)度，可在較高線速度下運(yùn)行，并可通過(guò)多柱切換/并聯(lián)提升產(chǎn)能與設(shè)備利用率。
應(yīng)用案例介紹
案例一：某重組疫苗疏水步驟純化
• 介質(zhì)：Diamond Butyl Mustang
• 樣品：經(jīng)復(fù)合模式層析捕獲洗脫后樣品
• 流動(dòng)相1：高鹽Buffer，pH7.0
• 流動(dòng)相2：低鹽Buffer，pH7.0
• 再生：超純水
Fig.1 某重組疫苗疏水步驟純化層析及電泳圖
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
疏水層析后SEC純度提高3%以上。
案例二：某重組蛋白疏水層析純化
• 層析柱：BXK16/20 10cm bed height, CV=20mL
• 介質(zhì)：Phenyl Bestrose 6 Fast Flow (high sub)
• 樣品：酵母培養(yǎng)上清，加入0.5M硫酸銨
• 樣品體積：450ml (22.5 c.v.)
• 流速：300cm/h (loading) 60cm/h (elution)
Fig.2 某重組蛋白疏水純化層析圖譜
案例三：某重組蛋白疏水層析應(yīng)用
• 介質(zhì)：Phenyl Bestrose 6 Fast Flow (high sub)
• 樣品： 用0.22μm濾膜過(guò)濾后
• 流動(dòng)相1：高鹽Buffer pH7.2
• 流動(dòng)相2：低鹽Buffer pH7.2
Fig.3 某重組蛋白疏水步驟純化層析及電泳圖
HIC技術(shù)參數(shù)優(yōu)化關(guān)鍵點(diǎn)
配基選擇
• 短鏈烷基配基（丁基、丁硫基等）：
疏水性較弱，適合疏水性較強(qiáng)或穩(wěn)定性較差的蛋白，避免結(jié)合過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致洗脫困難或活性下降。
• 長(zhǎng)鏈烷基配基（辛基等）：疏水性中等偏強(qiáng)，適合疏水性中等的蛋白，通過(guò)增強(qiáng)結(jié)合力提高分離效率。
• 芳香族配基（苯基等）：疏水性最強(qiáng)，除疏水作用外，還可能參與π–π相互作用，對(duì)疏水性較弱、易流穿的蛋白尤其有效。
鹽的種類與濃度
• 促結(jié)合鹽選擇（Hofmeister 序列由強(qiáng)到弱）：硫酸銨 > 硫酸鈉 > 氯化鈉
• 常用濃度：
○ 上樣/平衡：1.0~1.5M硫酸銨（部分工藝可用至2.0M增強(qiáng)結(jié)合）。
○ 洗脫：線性降鹽或階梯降鹽濃度至接近0M。
注意：鹽濃度過(guò)高會(huì)增加溶液黏度、提升運(yùn)行壓力，并在進(jìn)柱端引發(fā)沉淀風(fēng)險(xiǎn)。
PH控制
• 建議范圍 pH 6–8：保持蛋白構(gòu)象穩(wěn)定，減少極端pH對(duì)配基和基質(zhì)的化學(xué)損傷。
• 對(duì)于構(gòu)象敏感或易聚集的蛋白，可在洗脫緩沖液中添加溫和助溶劑（如甘油、乙二醇）提高穩(wěn)定性。
小結(jié)
疏水作用層析憑借高選擇性、溫和洗脫條件、特定雜質(zhì)的高效清除能力，已成為重組蛋白純化流程中不可替代的單元操作。
典型應(yīng)用場(chǎng)景包括：
1. 對(duì)活性保持要求高且能耐受高鹽條件的酶、抗體等分子。
2. 電荷性質(zhì)與雜質(zhì)接近、難以通過(guò)IEX區(qū)分的蛋白。
3. 需要高效去除聚集體、疏水性HCP的工藝。
4. 鹽析或高鹽預(yù)處理后直接捕獲目標(biāo)蛋白。
通過(guò)合理選擇配基、精確設(shè)定鹽種類與梯度，結(jié)合pH等條件優(yōu)化，并與AEX/TFF等單元操作協(xié)同設(shè)計(jì)，能在重組蛋白工藝中實(shí)現(xiàn)更穩(wěn)健的純度與回收率平衡。
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