在探索生物系統復雜性的研究中，空間蛋白組學在揭示復雜組織的組織方式方面發揮著關鍵作用，近期，Nature Methods將空間蛋白組學評選為 2024 年度技術。空間蛋白組學涵蓋多種技術，主要目的是基于不同的檢測和分析方式來揭示組織中蛋白靶標的定位、細胞類型的組成和空間組織信息等。其中常用的一類空間蛋白組學是基于免疫組化/熒光原理的技術，包括CycIF、PhenoCycler-Fusion（CODEX升級版）、IBEX、MIBI和IMC。這些方法可以在同一張組織切片上實現超多重蛋白的檢測，生成高分辨率的空間圖像，揭示復雜的細胞組成及空間位置信息。
尤其是在腫瘤研究中，這些多重成像可通過檢測大量蛋白靶標來識別腫瘤中的細胞表型，包括細胞類型、亞型和功能狀態。例如，在多種癌癥中對免疫細胞景觀進行成像，發現免疫細胞組成與腫瘤特征的相關性。腫瘤細胞與周圍細胞和基質相互作用，通過這些多重蛋白成像可評估細胞-細胞之間相互作用可能性，包括同型和異型細胞間的相互作用。例如，在乳腺癌、肺癌和膠質母細胞瘤中，發現腫瘤細胞間多為同型相互作用，而異型相互作用如腫瘤細胞與免疫細胞間的相互作用對腫瘤功能有重要影響。腫瘤具有多種空間模式，從細胞局部聚集到空間大的區域結構，這些模式可以影響細胞間通訊。例如，通過不同的空間分析方法，確定細胞類型的分布、細胞互作的空間分布、定義局部富集模式等，發現空間模式與腫瘤預后、免疫細胞分布等的相關性。
丨 接下來帶你快速了解不同的空間蛋白組技術原理：
基于質譜的檢測方法：如成像質譜流式細胞術（IMC）和多重離子束成像（MIBI），可同時檢測40-50 種蛋白靶標。二者依靠質譜檢測與抗體偶聯的金屬同位素，MIBI通過離子束電離，IMC則是激光耦合電離等離子體源來實現電離。因檢測外源性偶聯到抗體上的非生物金屬同位素，因此可避免熒光和顯色技術的背景信號問題。但是兩者相對較低的掃描速度意味著相較于基于熒光檢測的方法，它們通常用于對更小組織區域的成像。
基于熒光檢測的方法：包括多光譜成像和迭代熒光方法。多光譜成像采用計算方法來分離重疊的熒光團發射光譜，已實現多達20種蛋白的成像。例如PhenoImager HT（之前名為 Vectra Polaris）以及較新的Orion都是市面上可買到的多光譜儀器。迭代熒光方法可實現對40–50 個蛋白靶標的熒光成像。其操作是每一輪染色和成像后，進行抗體剝離或熒光團滅活，然后再進行下一輪染色和成像。例如， MxIF采用化學猝滅實現熒光團滅活，IBEX和MELC通過漂白實現熒光團滅活，而在 t–CyCIF中兩種滅活方式結合使用。但是這些迭代熒光方法存在不足，實現高通量檢測所需的時間很長，其信號去除過程可能改變組織結構和抗原表位等問題。
基于寡核苷酸標記抗體的檢測方法：如由原來的CODEX技術升級為現在的PhenoCycler-Fusion（PCF）技術，該方法需要將抗體與DNA條形碼進行偶聯，偶聯抗體一次性添加到組織切片上，利用互補探針雜交和剝離方法實現循環成像。由于是抗體一次性添加，所以不存在上述迭代熒光方法中反復剝離和洗脫導致的抗原表位破壞影響抗體結合的問題。目前已發表的應用PCF技術的檢測通量最大可實現多達101種蛋白的同步成像。Akoya Biosciences 公司目前也推出了60種已驗證過的偶聯抗體組成的檢測panel，基本可滿足廣泛的對腫瘤微環境生物學的研究。除了已經驗證過的抗體，該技術可以方便的實現抗體偶聯的自主定制化。相比MIBI和IMC，PCF更適用于大片成像，或許更能全面的分析復雜的組織空間關系。
| 空間蛋白組圖像和數據分析
空間多重成像技術通過揭示細胞多樣性和相互作用改變了組織生物學的研究模式，但對其海量數據集的分析仍存在瓶頸。當前的分析流程可以概括為圖像采集后處理，包括圖像配準和校正（如通道串擾、背景、噪聲等）；細胞分割：借助不同算法，基于大量整理的訓練數據集；細胞特征量化與分類：量化蛋白質平均強度生成單細胞數據表，再通過多種方法分類，包括基于譜系蛋白標志物的過濾、門控、無監督聚類、監督機器學習建模；細胞表型分析：識別細胞類型相關功能蛋白并進一步分類（如耗竭 T 細胞）；空間分析：探索細胞間相互作用、定義微環境、分割微解剖結構并進行患者分層以獲取臨床見解。
當前的分析流程也存在很多挑戰。圖像二維性使分割算法在重疊或密集區域易出現細胞誤分類或遺漏。雖然新的細胞注釋方法不斷涌現，但尚無方法能夠整合空間數據和已有知識框架下同時解決重疊細胞的挑戰。另外分割的深度學習模型依賴大量高質量訓練數據集，而目前缺乏多樣化的可靠的真實數據，基于聚類的標簽不理想也會影響預測準確性。當前流程碎片化，錯誤易在步驟間累積，缺乏數據存儲、分析工作流程和可視化軟件的集成，導致研究者需在不同軟件和分析腳本間切換，不便于整合不同數據集信息。
雖然空間圖像分析面臨挑戰，但借助AI系統集成分析與可視化、構建無縫集成從圖像低階處理到空間分析各階段的模型、適應多樣數據集的智能算法及足夠計算基礎設施將助力突破，未來有望在空間生物學等領域取得新發現。
重點推薦：PCF空間單細胞蛋白組
相比其他空間蛋白組技術，PCF空間單細胞蛋白組學展現了多方面的優勢：（1）單細胞分辨率，可精確到250nm/piexl；（2）全片掃描，最大成像面積18mm X 35mm；（3）抗體一次性雜交，減少反復洗脫帶來的實驗誤差；（4）樣本兼容性高，新鮮冷凍切片和石蠟包埋組織切片均適用 ；（5）使用靈活, 既有商品化抗體Panel，也可定制化檢測；（6）檢測速度快，1分鐘成像100多萬個細胞。PCF空間單細胞蛋白組學技術應用場景非常廣泛，目前已經應用在腫瘤微環境研究、組織炎癥研究、以及胃腸道、神經、腎臟等其他組織結構的研究中。借助PCF技術強大的組織空間數據分析和挖掘能力，很多研究成果發表在Cell、Nature、Science等國際頂級期刊上。
總結與討論
目前空間蛋白組學研究已深入分析生物學機制，可分析大量患者隊列，揭示了細胞群體和多細胞空間關系可作為藥物靶點和生物標志物。空間蛋白組學將變革生命科學、生物醫學發現和轉化研究，推動精準醫學發展。對大量含臨床數據的人體組織樣本進行空間蛋白組學分析可研究細胞如何組裝成多細胞結構及細胞間的通信和功能互作關系，也可揭示高階組織結構對單個細胞調控機制的影響，結合靶向實驗將揭示生物學和醫學問題背后的細胞功能模塊。