膠質母細胞瘤(GBM)是成人最常見和最致命的原發性惡性腦腫瘤，在過去的20年里，盡管出現了許多新的治療方法，但除了標準療法(手術、放療和替莫唑胺)之外，膠質母細胞瘤的臨床治療計劃仍然不可用。目前，替莫唑胺(TMZ)是延長GBM患者總生存期的化療藥物，因其烷基化DNA的能力而被報道為傳統療法的基石。但是，由于其高度異質性和易突變性，它也是腫瘤耐藥性和復發的關鍵因素。因此，迫切需要確定克服TMZ阻力和提高其治療效果的更好方法。
近期，天津市環湖醫院閆華教授-佟小光教授-徐立霞副研究員團隊在Cancer Letters（IF 9.7）期刊上發表了題為“Ultrasound-excited temozolomide sonosensitization induces necroptosis”的文章。該研究首次發現TMZ在超聲(US)的影響下會產生活性氧(ROS)。這一特性使得TMZ-US療法在GBM治療中具有更好的療效。鑒于US在中樞神經系統(CNS)疾病中的使用日益增多，以及TMZ對GBM治療的重要性，有助于TMZ對相關膠質母細胞瘤治療的發展。中科新生命為該研究提供了4D Labelfree蛋白質組學技術服務。
研究材料
替莫唑胺(TMZ)、人膠質母細胞瘤（GBM）細胞
技術路線
步驟1：TMZ-US在體外增強TMZ對膠質瘤的化療敏感性；
步驟2：TMZ-US在體內增強抗腫瘤作用；
步驟3：差異甲基化基因和差異表達基因的綜合分析；
步驟4：TMZ-US通過增加ROS誘導膠質瘤細胞的壞死凋亡；
步驟5：TMZ-US不能誘導線粒體依賴性細胞凋亡。
研究結果
1. TMZ-US在體外增強TMZ對膠質瘤的化療敏感性
在本研究中，作者采用不同濃度的TMZ聯合相同超聲處理TBD、LN229、U87、U251、TMZ耐藥的U87/R和U251/R細胞。然后比較IC50值以確定聯合治療的致敏效果。CCK-8結果提示TMZ-US顯著增加了膠質瘤細胞的抑制率，并顯著降低了TMZ的IC50。同時，作者還檢測了細胞凋亡或壞死率和入侵能力，并觀察到TMZ-US組顯示出比US和TMZ組更高的細胞凋亡或壞死率，侵襲能力更低。ATP濃度的測定也獲得了類似的結果。研究表明，ROS在腫瘤細胞中的積累會導致生物分子的氧化，破壞脂質膜和蛋白質的完整性。因此，我們檢查了C11-BODIPY581/591的含量并在TMZ-US組中觀察到膜脂質過氧化的顯著增加。這些結果表明，TMZ-US破壞了線粒體膜電位，導致膜脂質過氧化，細胞功能受損（圖1）。
圖1 TMZ+US增強TMZ的化療敏感性
2.TMZ-US在體內增強抗腫瘤作用
作者隨后評估聯合治療對皮下腫瘤和神經膠質瘤的抑制作用,與TMZ組相比，使用TMZ-US治療皮下腫瘤時，觀察到腫瘤生長受到顯著的抑制。當治療患有顱內膠質瘤的小鼠時，TMZ-US聯合治療組的體內改善結果顯示出比TMZ組進一步抑制腫瘤生長速率。相反，荷瘤小鼠的Kaplan-Meier生存曲線顯示顯著延長的存活率。因此，為了了解聯合治療的毒性作用，研究人員同時監測了體重變化。結果表明，兩組之間的體重變化無顯著差異。此外，免疫組織化學染色顯示，TMZ-US增加了腫瘤組織中的DNA損傷(γ-H2AX)和凋亡(裂解的caspase3)，并降低了與細胞增殖和侵襲相關的多種指標的表達，包括Ki67、MMP2和N-Cadherin，這些結果表明，TMZ-US療法增強了DNA的TMZ損傷，誘導了更高的凋亡和更低的侵襲性(圖2)。
圖2 TMZ+US聯合比TMZ治療能更好地抑制腫瘤生長
3. 差異甲基化基因和差異表達基因的綜合分析
作者使用多組學分析來探討TMZ-US對膠質瘤細胞產生的影響。轉錄組學分析TMZ-US誘發的腫瘤死亡機制。首先，對比NC、TMZ和TMZ-US，結果識別出5005個差異。KEGG對這些差異表達基因的富集分析顯示，TNF信號通路與TMZ-US效應關系最為密切。接下來，為了進一步研究TMZ-US療法的機制，進行了多組學分析。基于RNA-seq的KEGG結果，分析了腫瘤壞死因子(TNF)的啟動子甲基化。結果表明，與TMZ組相比，該啟動子發生了超甲基化。最后，對TMZ-US和TMZ-US的DEGs進行了綜合分析。綜合多組學分析和實驗結果，可以發現TMZ-US引起TNF-α表達水平升高，這可能與其啟動子甲基化水平降低有關。此外，也發現壞死凋亡得到富集（圖3）。
圖3 WGBS與RNA-seq的綜合分析
4. TMZ-US通過增加ROS誘導膠質瘤細胞的壞死凋亡
根據綜合分析結果，探查了細胞壞死性凋亡，以確定原發性細胞損傷是否由TMZ-US引起。首先，我們使用了各種細胞死亡抑制劑來探查TMZ-US治療后的細胞死亡模式。發現在較高的TMZ濃度下，細胞出現壞死性下垂。進一步探索了聯合治療后不同抑制劑濃度對細胞的作用,Nec-1和NAC對TMZ-US誘發的細胞死亡具有劑量依賴性效應。ROS水平升高導致TMZ-US誘導的壞死凋亡。進行Western blotting分析結果顯示，TMZ-US上調了p-RIP1、p-RIP3、p-MLKL或RIP1、RIP3、MLKL，但NAC阻止了這種上調。此外，在ATP濃度測定中也獲得了類似的結果。這些結果均表明TMZ-US激活ROS誘導細胞壞死凋亡(圖4)。
圖4 TMZ + US通過增加活性氧誘導膠質瘤細胞壞死
5. TMZ-US不能誘導線粒體依賴性細胞凋亡
為進一步探索TMZ-US對線粒體依賴性凋亡的影響。研究人員對細胞色素c與線粒體共定位和線粒體蛋白質組學研究。得出以下結論: 1、TMZ-US主要影響細胞核內的位點；2、TMZ-US不影響與線粒體依賴性凋亡有關的蛋白；3、TMZ-US主要影響生物過程(圖5)。
圖5 TMZ-US不能誘導線粒體依賴性細胞凋亡
文章小結
本研究提出了TMZ對GBM的超聲動力化療。本文通過理論計算和實驗證實TMZ可能是一種超聲作用下產生ROS的聲敏劑。此外，TMZ-US在體內和體外均可增強TMZ化療療效，逆轉TMZ耐藥。最終，通過多組學綜合分析并實驗驗證，TMZ-US主要通過ROS誘導膠質瘤細胞的壞死凋亡發揮抗腫瘤作用。本文工作主要在天津市環湖醫院神經外科研究所完成。文章的第一作者分別是王釩臣（天津醫科大學研究生）、徐立霞、聞斌禮（天津醫科大學研究生）；通訊作者是閆華、佟小光、王銀松（天津醫科大學）。
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