根據(jù)文獻方法部分描述，研究團隊在原位雜交（In situ hybridization）中使用了AAT Bioquest的Styramide™ Signal Amplification (PSA™)系統(tǒng)（酪胺信號放大技術），具體用于檢測地高辛（DIG）標記的探針。以下是詳細解析：
一、標記對象與標記方法
1.標記對象：
①針對斑馬魚嗅覺玫瑰花結（Olfactory Rosette, OR）中的 paqr5b mRNA，使用DIG標記的反義RNA探針（Antisense probe）。
②通過抗地高辛-POD（辣根過氧化物酶）結合探針后，利用酪胺信號放大系統(tǒng)增強熒光信號。
2.標記步驟：
①探針結合：DIG標記的RNA探針與目標mRNA結合
②酶聯(lián)反應：使用抗DIG-POD抗體（Fab片段）與探針結合。
③信號放大：加入HRP底物（酪胺衍生物Styramide™），在HRP催化下，酪胺底物被激活并共價沉積在目標位點 附近，形成高密度的熒光標記。
二、染料的優(yōu)點與特點
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特性 |
TSA技術 |
傳統(tǒng)熒光標記 |
堿性磷酸酶系統(tǒng) |
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靈敏度 |
提高10-100倍 |
低 |
中等 |
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空間分辨率 |
高（局部沉積） |
低（擴散背景） |
中等 |
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多色兼容性 |
支持多通道（FITC/Cy3/Cy5） |
有限 |
需不同顯色底物 |
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適用樣本 |
組織切片、低豐度靶標 |
高表達靶標 |
中等表達靶標 |
三、文獻中的實驗流程與結果
1. 樣本固定與切片
↓
2. 探針雜交（DIG標記的paqr5b反義探針）
↓
3. 抗DIG-POD抗體結合
↓
4. Styramide™ PSA信號放大（HRP催化）
↓
5. 熒光顯微鏡成像
↓
6. 定量分析（如神經元密度與信號強度）
顯微圖像示例
斑馬魚嗅覺玫瑰花結（OR）的paqr5b mRNA定位（文獻圖8：左為野生型，右為突變體；紅色箭頭指示paqr5b mRNA信號缺失）
結果解讀：
①野生型斑馬魚OR中，paqr5b mRNA在神經元中高表達（綠色熒光信號）。
②paqr5b?/?突變體中，信號完全消失，證實基因敲除有效性。
③TSA技術的高靈敏度揭示了神經元亞群中的細微表達差異。
總結
AAT Bioquest的Styramide Signal Amplification系統(tǒng)通過酶促信號放大與高分辨率熒光標記，成為復雜生物樣本研究的“黃金標準”。其在低豐度靶標檢測、多色復用及精細結構成像中的優(yōu)勢，為神經科學、癌癥研究與發(fā)育生物學提供了不可替代的技術支持。結合本文案例，該技術未來在單細胞組學與空間轉錄組學中的應用潛力巨大。