在現(xiàn)代生命科學中，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)——即其氨基酸序列——早已不再被視為靜態(tài)的分子代碼。它不僅決定蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和功能特性，更深刻影響細胞行為、信號通路動態(tài)、甚至進化路徑與疾病機制。由此，獲取蛋白質(zhì)準確序列，成為深入理解其生物學功能與作用機制的起點。
不同于傳統(tǒng)“蛋白鑒定”中的“歸類識別”，蛋白測序（Protein Sequencing）關注的是完整而連續(xù)的氨基酸信息，用于解析未知蛋白、識別序列突變、確認藥物蛋白一致性或追蹤翻譯后修飾等關鍵科研任務。在生物藥開發(fā)、個體化醫(yī)學、結(jié)構(gòu)生物學、抗體工程等高精度領域，蛋白測序技術的精細化能力日益成為研究和應用決策的關鍵技術杠桿。
一、蛋白測序 ≠ 蛋白鑒定
在蛋白質(zhì)組學研究中，“測序”“鑒定”等術語常被交替使用，導致術語誤用、技術選擇失誤甚至研究假設混淆。
從定義上講，蛋白測序是指對蛋白質(zhì)進行氨基酸序列解析的過程，旨在重建其一級結(jié)構(gòu)的連續(xù)排列，通常以N端到C端的方向表示全部或部分氨基酸序列。其目標是獲取“序列本體”，而非僅判斷蛋白的“存在性”或“類別歸屬”。
相比之下：
蛋白鑒定（Protein Identification）：依賴質(zhì)譜-數(shù)據(jù)庫匹配，確定某一肽段是否“屬于”某已知蛋白。它是分類式的“歸屬判斷”，而非逐位點的信息重建。
二、蛋白測序技術的演化
1、Edman 降解：高精度線性識別的開端
Edman 降解由 Pehr Edman 于20世紀50年代建立，是蛋白質(zhì)序列解析的首次化學實現(xiàn)。該方法基于苯異硫氰酸（PITC）對N端氨基酸的專一性反應，通過順序性標記與切除，在每一輪循環(huán)中釋放并鑒定一個PTH-氨基酸，進而實現(xiàn)線性序列重建。
圖1. Edman降解法示意圖
Edman法的突出優(yōu)點是：單個氨基酸級別的識別精度極高，誤差可控，但缺點也很明顯：
● 僅適用于具有游離N端的純化樣品；
● 序列長度受限，通常不超過30-50殘基；
● 無法處理混合物或修飾蛋白。
盡管如此，它在現(xiàn)代蛋白藥物與合成肽驗證中仍具獨特優(yōu)勢，如合成肽質(zhì)量驗證、重組蛋白N端信號肽切除效率評估、以及生物制品結(jié)構(gòu)一致性評估等。
2、Bottom-up 質(zhì)譜策略：高通量測序的技術中樞
質(zhì)譜技術的引入，是蛋白測序發(fā)展中的關鍵轉(zhuǎn)折點。Bottom-up 策略將蛋白質(zhì)通過特異性蛋白酶（如胰蛋白酶）酶解為短肽段，通過LC-MS/MS對肽段進行碎裂與檢測，再借助數(shù)據(jù)庫比對或de novo算法重建蛋白質(zhì)序列。
Kellie, J. F. et al. Mol Biosyst. 2010.
圖2. 自下而上和自上而下策略對比示意圖
該策略具備良好的通量、覆蓋度與適配性，已成為目前最廣泛應用的蛋白測序方法。然而，Bottom-up 本質(zhì)上是一種間接的序列推導方式，其測序能力存在以下結(jié)構(gòu)性限制：
● 序列上下文信息缺失，影響跨肽段修飾重建；
● 修飾定位依賴碎片完整性，存在識別歧義；
● 對于高度異構(gòu)蛋白、融合蛋白或非模式生物蛋白，de novo測序仍面臨準確率瓶頸。
盡管如此，Bottom-up 的策略在蛋白組學、抗體序列初篩、生物藥殘留分析等場景中仍是不可替代的核心工具。
3、Top-down 質(zhì)譜策略：整分子結(jié)構(gòu)識別的深入拓展
Top-down 測序策略跳過酶解步驟，直接將完整蛋白質(zhì)送入高分辨率質(zhì)譜系統(tǒng)，通過高能碎裂（如ETD、HCD、EThcD）解析其多級碎片離子，實現(xiàn)對一級結(jié)構(gòu)的整分子解析。
Kellie, J. F. et al. Mol Biosyst. 2010.
圖3. 自上而下策略原理示意圖
該方法可在不破壞蛋白天然修飾組合的前提下，提供精確的序列與修飾定位信息，特別適用于：
● 蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM）識別；
● 等電點異構(gòu)體區(qū)分；
● 生物藥質(zhì)量屬性評估。
Top-down 的主要技術挑戰(zhàn)包括：
● 高分子量蛋白碎片圖譜解析難度大；
● 對質(zhì)譜平臺分辨率、離子累積能力要求極高；
● 樣本純度、穩(wěn)定性需嚴格控制。
盡管其在通量和樣品適應性方面不及 Bottom-up，Top-down 在某些研究方向卻不可替代，尤其是在需要保證結(jié)構(gòu)連續(xù)性、修飾組合保真性、異構(gòu)體清晰分離的情境下。例如抗體CDR區(qū)的微突變識別、PTM互作網(wǎng)絡的建立、以及某些生物藥的結(jié)構(gòu)一致性備案等。
4、單分子蛋白測序的興起
傳統(tǒng)質(zhì)譜測序策略均建立在肽段碎裂與譜圖反演重建的邏輯基礎之上。這種方法雖然成熟、通量高、適應性強，但其依賴片段信息進行反推的過程，天然存在分辨歧義、修飾丟失和鏈內(nèi)關聯(lián)缺失等局限性。近年來，研究者開始嘗試發(fā)展無需酶解、無需拼接、可直接讀取氨基酸順序的單分子測序（Single-Molecule Protein Sequencing, SMPS）技術。這類技術的核心理念是：在不破壞蛋白整體結(jié)構(gòu)的前提下，實現(xiàn)對單個分子的逐殘基識別。
Restrepo-Pérez, L. et al. Nature Nanotech. 2018.
圖4. 單分子蛋白測序基本流程與主要技術路徑
（1）納米孔測序（Nanopore-Based Sequencing）
納米孔測序策略依托于生物或固態(tài)孔道的亞納米級空間分辨能力，將蛋白質(zhì)或短肽分子引導通過孔道通道，在此過程中監(jiān)測穿孔分子的阻抗變化（ionic current blockade）。不同氨基酸殘基的體積、電荷與疏水性等性質(zhì)影響其在孔道中的空間占據(jù)與局部電流擾動，從而產(chǎn)生特征信號。
● 代表平臺：Oxford Nanopore；
● 技術優(yōu)勢：理論上可在不拆分蛋白結(jié)構(gòu)的條件下獲取線性序列信息；
（2）熒光法測序（Fluorescence-Based Sequencing）
熒光測序方法通過對特定氨基酸類型引入可識別的熒光標記團，并將肽鏈固定于表面載體。隨后，采用順序化學處理或酶促降解逐步移除殘基，同時利用高靈敏度多通道熒光成像系統(tǒng)記錄每個周期所釋放信號的光譜特征，從而推導殘基順序。
● 代表平臺：Quantum-Si、Alamar Biosciences；
● 技術優(yōu)勢：理論上可應用于復雜背景中的微量樣本，支持特定氨基酸的高特異性識別；
蛋白測序缺乏模板依賴、具有天然異質(zhì)性、并常伴隨多重翻譯后修飾，其測序結(jié)果通常不具有唯一性，而是建立在實驗策略、物理分辨率與數(shù)據(jù)模型之間動態(tài)權(quán)衡的基礎上。本文梳理的幾類測序技術路徑，從化學降解到質(zhì)譜分析，再到單分子水平的直接讀取，實質(zhì)上構(gòu)成了一套彼此補償?shù)男畔@取體系。這些方法并非相互替代，而是在面對不同研究目標與樣本約束條件下，為實現(xiàn)結(jié)構(gòu)精確性、序列覆蓋率與修飾還原度之間的平衡提供了策略支持。
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