Q1：Label-Free Quantification (LFQ)的技術特點是什么？
A1：
1、無需化學或同位素標記
直接基于質譜信號進行定量，避免了標簽引入的額外步驟與成本。
2、準確度略低于標記定量
由于缺乏內源性或外源性標簽的校正，LFQ 的定量精確性通常略低于 SILAC、TMT 等標記方法。
3、樣本通量高、靈活性強
不受標簽通道數量限制，可同時分析更多樣本，適合大規(guī)模研究。
4、對實驗一致性要求高
定量結果易受樣品前處理、液相色譜穩(wěn)定性和儀器狀態(tài)影響，需要嚴格的質量控制與歸一化處理。
5、至少需要 3 個技術和生物學重復
以提高數據的統(tǒng)計可靠性，降低實驗波動對定量結果的影響。
Q2：LFQ 主要有哪些常用定量策略？
A2：Label-Free Quantification（LFQ）主要有以下兩種常用定量策略：
1、峰面積積分（Area Under the Curve, AUC）
通過提取 MS1 層面的色譜峰并計算曲線下面積，反映肽段在不同樣品中的相對豐度，精度較高，適合檢測信號穩(wěn)定且峰形良好的數據。
2、譜圖計數（Spectral Counting）
統(tǒng)計目標蛋白質在 MS/MS 中被采集和鑒定的譜圖次數，用于估算相對豐度，方法簡單，但對低豐度蛋白的敏感性較差。
Q3：在 LFQ 中，DDA 和 DIA 哪種采集模式更優(yōu)？
A3：在 LFQ（Label-Free Quantification）中，DIA（Data-Independent Acquisition）通常更優(yōu)，原因如下：
- DDA（Data-Dependent Acquisition）
依據信號強度選擇前體離子進行碎裂，適合探索性鑒定，但低豐度肽段易漏檢，跨樣本數據缺失率較高。
- DIA（Data-Independent Acquisition）
采用全譜采集方式，覆蓋所有前體離子，數據重復性和一致性好，缺失值率低，尤其適合大規(guī)模、多批次 LFQ 項目。
總結：若目標是提高定量一致性、減少缺失值并適應大規(guī)模比較分析，推薦 DIA；若是以新蛋白發(fā)現為主的探索性研究，DDA 仍有應用價值。
Q4：為什么無標記定量蛋白質組學，可以比較不同類型的樣品？
A4：無標記定量基于質譜信號強度或譜圖計數進行相對定量，不依賴統(tǒng)一的化學或同位素標簽。只要不同類型的樣品在前處理、色譜條件、質譜采集和數據分析流程上保持一致，并通過保留時間對齊等算法識別相同肽段，就能實現跨樣品類型的蛋白豐度比較。
Q5：如何解決 LFQ 中的缺失值問題？
A5：無標記定量蛋白質組學本質上依賴質譜信號的強度對蛋白質進行相對定量，因此，任何一個步驟的波動，如樣本前處理、液相分離穩(wěn)定性、質譜儀性能狀態(tài)等，都會導致信號丟失或檢測不到，表現為數據矩陣中的大量缺失值（Missing Values）。
為減少缺失值影響，可采取以下措施：
1、優(yōu)化樣品前處理，降低蛋白降解與肽段損失。
2、保持色譜與質譜系統(tǒng)穩(wěn)定，減少峰漂移與信號波動。
3、增加技術和生物學重復，提高檢測覆蓋率與統(tǒng)計可靠性。
4、采用 DIA 等全譜采集模式，降低低豐度肽段漏檢率。
5、在數據分析中合理填補缺失值（如低豐度假設插補），并結合歸一化提高比較精度。
Q6：進行 LFQ 時，如何處理共享肽段（shared peptides）？
A6：共享肽段是指來源于多個蛋白質、序列完全相同的肽段。處理方式主要有兩種：
1、排除法：在定量計算中僅使用 wéi yī 肽段（unique peptides），避免共享肽段引入的歸屬不確定性。
2、分配法：基于概率模型或肽段在各蛋白的 wéi yī 肽段信號比例，將共享肽段信號按比例分配到對應蛋白，從而保留更多定量信息。
選擇方法取決于研究目的：探索性研究可優(yōu)先保留信息（分配法），而高精度定量通常傾向于排除法。
Q7：在 LFQ 中，如何判斷定量結果的顯著性？
A7：需結合統(tǒng)計檢驗（如 t 檢驗、ANOVA）與多重假設檢驗校正（FDR 控制），并建議結合生物學重復計算變異系數（CV）來評估定量的穩(wěn)健性。
Q8：非標記定量蛋白質組學和標記定量蛋白質組學的適用場景有何差別？
A8：
1、非標記定量（LFQ，尤其是 DIA 模式）
更適合樣本組數較多（通常超過 10 組）、來源差異較大（不同物種、組織或部位）的平行蛋白組定量研究。適用于需要判斷蛋白是否存在、追求高精度定性與定量、并希望避免標簽或分組帶來的系統(tǒng)誤差的項目。同時，采集的數據可多次進行深度挖掘與再分析。
2、標記定量（如 TMT、iTRAQ、SILAC）
更適合同時比較的樣本數較少（通常 ≤10 組），且樣本背景一致性較高（同一物種、相同類型樣本）的實驗設計。在這些情況下，標記定量能在單次質譜運行中實現多樣本的高精度比較，降低批次效應。
Q9：如何在 LFQ 中判斷“有無”表達差異？
A9：對同一樣本的多次質譜檢測結果通常不會完全一致，重疊率大概為70%。為了后續(xù)統(tǒng)計分析的合理性，一般僅保留在三次技術重復中至少兩次被鑒定（即具有非零定量值）的蛋白質，并以平均值進行定量。如果某蛋白在一組樣本的三次重復中均無定量值（或定量值為零），而在另一組中至少兩次出現非零定量值，則可初步判斷存在“有無”差異。不過，這類差異的結論需謹慎對待，建議結合其他驗證手段（如 PRM、Western blot）進行確認。
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