一、非靶向代謝組學
非靶向代謝組學是一種全面、無偏的分析策略，旨在對生物樣本中所有可檢測的小分子代謝物進行全譜檢測，無需預先設定分析目標。該技術結合高分辨率質譜平臺（如液相色譜-質譜聯(lián)用和氣相色譜-質譜聯(lián)用）以及多種色譜分離方法（如反相色譜、親水色譜 ），可實現(xiàn)對已知與未知代謝物的定性及半定量分析。
Khoomrung, S. et al. Front Pharmacol. 2017.
圖1. 非靶向代謝組學分析流程
非靶向代謝組學可涵蓋多類關鍵代謝物，如氨基酸、有機酸、脂類、膽固醇、脂肪酸、糖類和核苷酸。通過高效的樣本處理流程與精密儀器平臺，非靶向代謝組學可用于全面監(jiān)測不同生理或病理狀態(tài)下的代謝物變化，廣泛應用于基礎醫(yī)學研究、臨床研究、微生物學與營養(yǎng)科學等領域。
二、血漿代謝組學
血漿是代謝組學中最常用的樣本類型之一，能夠反映多個器官與系統(tǒng)的整體代謝狀態(tài)。由于血漿含有高豐度的蛋白和脂類，其樣本前處理的關鍵在于高效提取低豐度代謝物并去除干擾成分。常用策略包括有機溶劑（如甲醇）沉淀蛋白，輔以固相萃取（SPE）、膜過濾或在線蛋白去除系統(tǒng)以提升信噪比。對于極性差異顯著的代謝物，還可采用雙相萃取法實現(xiàn)極性與非極性代謝物的分離，利于脂質類和親水性小分子的并行分析。
Wawrzyniak, R. et al. Sci Rep. 2018.
圖2. 血漿代謝組學樣品處理流程
在分離與檢測方面，非靶向代謝組學采用高分辨率液相色譜-質譜聯(lián)用技術（LC-HRMS）進行代謝物分析。通過多模式分離策略，如反相色譜和親水作用色譜，可覆蓋多種代謝物，確保對低豐度代謝物的全面檢測。質譜部分通常采用如 Orbitrap 或 Q-TOF 等高分辨率質譜儀，能夠精確測定代謝物的質荷比（m/z），并進行初步結構識別。結合依賴數(shù)據(jù)采集（DIA）與非依賴數(shù)據(jù)采集（DDA）模式，該方法進一步提升了未知代謝物的識別能力，確保數(shù)據(jù)的完整性與準確性。
三、糞便代謝組學
糞便代謝組學廣泛應用于炎癥性腸病、代謝綜合征、肝腸軸研究等領域，是連接腸道微生物組與宿主代謝的重要研究工具。處理流程通常包括冷凍研磨、均質化、極性或混合有機溶劑（如甲醇、水、異丙醇）提取代謝物。可根據(jù)研究需求選擇單相或雙相萃取策略。高通量離心、過濾用于去除顆粒物，有時結合冷凍干燥以濃縮樣本并增強檢測靈敏度。
Karu, N. et al. Anal Chim Acta. 2018.
圖3. 糞便代謝組學中樣品處理流程
在分離與檢測方面，糞便代謝組學通常將反相色譜與親水色譜相結合，并聯(lián)用高分辨率質譜（如 Orbitrap 或 Q-TOF）進行全掃描分析。該方法可覆蓋多種代謝物類型，包括短鏈脂肪酸、膽汁酸、吲哚類化合物、脂質、苯丙素類化合物及微生物特異性代謝產(chǎn)物。由于糞便樣本基質復雜、個體間差異大，數(shù)據(jù)分析通常需要引入穩(wěn)定的內標物、批次效應校正以及多變量統(tǒng)計方法，以保證結果的可比性與生物學解讀的準確性。
四、細菌代謝組學
細菌代謝組學用于探索微生物代謝通路、菌株功能及其對外部刺激（如藥物、環(huán)境）的響應，分為胞內和胞外代謝物分析。胞內代謝物處理包括迅速終止代謝（如使用冷溶劑），并通過玻璃珠破碎或凍融法裂解細胞。胞外代謝物則通過離心去除細胞后，從培養(yǎng)上清中提取，常結合固相萃取純化。
Mohd, Kamal, K. et al. Biochem Res Int. 2022.
圖4. 細菌代謝組學中樣品處理流程
對于血漿、糞便與細菌樣本的代謝物檢測，非靶向代謝組學均采用高分辨率質譜（如 Orbitrap 或 Q-TOF）聯(lián)用多模式色譜方法進行全掃描檢測。為確保數(shù)據(jù)可比性與生物學解讀，通常需結合內標校正、批次效應處理及多變量統(tǒng)計分析。
五、代謝物分析
1、脂質分析
在非靶向代謝組學中，脂質組學通過全面分析脂質的多樣性和動態(tài)變化，揭示脂質在疾病發(fā)展中的關鍵角色。樣品提取是脂質組學中的關鍵步驟，常用的提取方法包括Folch法和Bligh-Dyer法，它們能有效從細胞或組織樣本中提取脂質。此外，超臨界流體萃?。⊿FE）作為一種新興技術，能高效提取低豐度脂質，減少傳統(tǒng)溶劑的使用并提高脂質回收率。脂質鑒定方法中，除了常見的質譜技術外，液相色譜-串聯(lián)微流控芯片技術（LC-MC）通過微流控芯片與液相色譜的結合，提升了脂質分離的效率，特別適用于復雜樣本的高通量篩查。二維液相色譜（2D-LC）則結合不同的分離機制，能顯著提高脂質的分辨率，從而更精確地分析復雜脂質樣本。核磁共振（NMR）技術也被應用于脂質組學，能夠提供脂質分子的空間結構信息，尤其適用于復雜脂質的定性分析。脂質組學的這些新型技術，使脂質的檢測更為精確，推動了脂質在疾病研究和生物標志物發(fā)現(xiàn)中的應用。
Ahluwalia, K. et al. Metabolites. 2022.
圖5. 脂質組學分析流程
2、氨基酸分析
非靶向氨基酸分析的難點主要在于結構類似物（如同分異構體）難以區(qū)分、部分氨基酸極性強導致保留性能差，以及易受基質干擾影響定量準確性。為確保分析質量，需在前處理階段優(yōu)化蛋白沉淀和衍生化策略，提高目標化合物的提取效率與信號響應；色譜分離階段需選擇合適的反相或親水作用色譜柱以提升解析度；質譜檢測中應采用高分辨和高精度儀器，結合多級質譜信息增強結構判別能力。此外，數(shù)據(jù)處理階段需嚴格篩選背景噪聲和誤配結果，確保差異氨基酸的準確識別與代謝路徑注釋。
3、膽汁酸分析
膽汁酸在非靶向代謝組學分析中作為重要的代謝物，常通過液相色譜-質譜聯(lián)用（LC-MS）技術進行檢測。LC-MS可以高效分離膽汁酸的多種異構體，如原膽酸、去氧膽酸及其衍生物，并提供定性定量分析。通過非靶向分析，研究人員能夠識別不同病理狀態(tài)下膽汁酸的代謝變化，揭示其在代謝紊亂或疾病進程中的潛在作用。非靶向分析相比靶向分析具有更廣泛的覆蓋面，能夠在沒有預設目標物的情況下發(fā)現(xiàn)新的膽汁酸代謝物，提升研究的全面性。這為膽汁酸在疾病診斷中的應用，特別是在肝病、代謝疾病中的潛在標志物發(fā)現(xiàn)，提供了有力的數(shù)據(jù)支持。
Marques, CF. et al. Separations. 2023.
圖6. 代謝物非靶向代謝組學分析流程
六、代謝通路分析
代謝通路分析是非靶向代謝組學中至關重要的一環(huán)，旨在將檢測到的代謝物映射到已知的生物代謝通路，識別在特定條件下顯著擾動的代謝網(wǎng)絡。分析過程包括代謝物注釋、通路匹配、富集分析和影響因子評估。通過整合代謝物變化、通路拓撲結構和網(wǎng)絡關鍵節(jié)點，揭示潛在的生物機制，為疾病研究、藥物開發(fā)和營養(yǎng)干預提供深入見解。
Han, J. et al. Front Mol Biosci. 2021.
圖7. 代謝通路分析流程
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