以下是小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞的提取步驟：
1.實驗動物：選用健康的小鼠，一般為清潔級或SPF級，6-8周齡，體重根據(jù)品系有所差異，通常在18 - 22g左右。提前將小鼠置于適宜的飼養(yǎng)環(huán)境（溫度22-25℃，濕度50%-60%，12h光照/12h黑暗循環(huán)）中適應(yīng)1-2天。
2.實驗試劑：無菌PBS（磷酸鹽緩沖液）,(啟達生物，貨號：SD0029)
0.1%-0.2%（w/v）膠原酶Ⅱ溶液
ECGM-M內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基（啟達生物，貨號：P1001-M）
紅細胞裂解液（啟達生物，貨號：SD0063）
細胞包被液(啟達生物，貨號：SD0044)
3.實驗器材：
手術(shù)器械：包括眼科剪、眼科鑷、手術(shù)刀等，需提前高壓滅菌處理。
培養(yǎng)皿、離心管、移液管、滴管等：均需為無菌一次性用品。
細胞篩：孔徑為70μm和40μm，用于過濾組織懸液，去除較大的組織碎片。
離心機：用于細胞的離心沉淀。
培養(yǎng)箱：設(shè)置溫度為37℃，含5%CO?的飽和濕度環(huán)境，為細胞提供適宜的生長條件。
提取步驟
1.小鼠處死與取材：
將小鼠用頸椎脫臼法或過量麻醉劑（如戊巴比妥鈉，劑量為50-100mg/kg體重）處死，迅速將其仰臥固定于解剖板上。
用75%酒精消毒腹部皮膚，沿腹部正中線剪開皮膚和腹壁，暴露胸腔。
用眼科剪小心剪開胸腔，充分暴露心臟和肺臟。
用注射器經(jīng)右心室向肺動脈內(nèi)注入約5ml無菌PBS，直至肺臟變白，以沖洗掉肺內(nèi)的血液。
用眼科剪小心剪下肺臟，放入盛有預(yù)冷無菌PBS的培養(yǎng)皿中，輕輕漂洗2-3次，去除表面的血跡和雜質(zhì)。
2.組織剪碎與消化：
將漂洗后的肺臟轉(zhuǎn)移至新的無菌培養(yǎng)皿中，用眼科剪將肺組織剪成約1mm³的小塊。
將剪碎的肺組織塊轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量的膠原酶Ⅱ溶液（每克肺組織約加入5-10ml），輕輕混勻。
將離心管用封口膜密封好置于37℃水浴中消化30-60min，期間每隔5-10min輕輕振蕩一次，使消化充分。
3.細胞懸液制備：
消化結(jié)束后，將離心管取出，800-1000r/min離心5 - 10min，棄去上清液。
向沉淀中加入適量的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，室溫靜置5-10min，以裂解紅細胞。
再次800-1000r/min離心5min，棄去上清液。
用適量的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基重懸沉淀，然后依次通過70μm和40μm的細胞篩，去除較大的組織碎片，得到單細胞懸液。
4.細胞接種與培養(yǎng)：
將單細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，800-1000r/min離心5 min，棄去上清液。
用適量的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，調(diào)整細胞密度至（1 -2）×10^6cells/ml。
將細胞懸液接種于預(yù)先包被有明膠或纖連蛋白的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
培養(yǎng)12小時后，輕輕倒掉培養(yǎng)液，用無菌PBS輕輕漂洗2-3次，去除未貼壁的細胞，然后加入新鮮的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
后續(xù)觀察與鑒定
1.細胞觀察：
在培養(yǎng)過程中，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)，記錄細胞的貼壁情況、生長速度、形態(tài)變化等。正常的肺微血管內(nèi)皮細胞呈鋪路石樣外觀。
2.細胞鑒定：
培養(yǎng)至細胞融合度達到70%-80%時，可進行細胞鑒定。常用的鑒定方法包括免疫熒光染色檢測內(nèi)皮細胞特異性標志物（如CD31、vWF等）、攝取乙?；?span id="foenuhe" class="wx_search_keyword_wrap" style="color: var(--weui-link);">低密度脂蛋白（Ac - LDL）等。
以上步驟僅為一般的小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞提取方法，實際操作中可根據(jù)具體實驗要求和實驗室條件進行適當調(diào)整。
推薦產(chǎn)品:
ECGM-M小鼠內(nèi)皮培養(yǎng)基（貨號：P1001-M）
內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基經(jīng)10種人各部位的內(nèi)皮細胞的測試和優(yōu)化，經(jīng)無菌，無支原體，無內(nèi)毒素檢測，添加肝素，內(nèi)皮生長因子，胰島素，抗氧化劑，皮質(zhì)醇等組分，為了實現(xiàn)細胞的正常的新陳代謝過程，培養(yǎng)基盡量減少生長刺激的因子組分。
適用除人源外哺乳動物內(nèi)皮細胞的生長。
免程序降溫細胞凍存液（低血清）（貨號：SD0001）
讓細胞凍存更加方便：
1.它無需程序降溫，細胞凍存后直接放入-80°過夜，24小時移入液氮即可。
2.它含有2%的血清，含有抗氧化劑和細胞休眠時所細胞的蛋白質(zhì)和氨基酸。
3.它只含有5%DMSO,因為DMSO一旦濃度過高會導(dǎo)致細胞在凍存時中毒，復(fù)蘇細胞存活少，或者長時間不長。
提取步驟