抗體：結構與純化挑戰(zhàn)
抗體（Antibody）是機體針對抗原刺激產生的特異性免疫球蛋白（Ig），是體液免疫反應的重要效應分子。抗體主要由兩條重鏈（heavy chain，H）和兩條輕鏈（light chain，L）組成（見Fig.1）。根據(jù)重鏈恒定區(qū)氨基酸組成和排列順序的不同，分為IgM、IgD、IgG、IgA 和IgE五類，其中IgG是治療性抗體中最常見的形式。
同一類的Ig，根據(jù)其鉸鏈區(qū)氨基酸組成和重鏈二硫鍵的數(shù)量及位置的不同，又分為不同的亞類（subclass），如人IgG可分為四個亞類，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。輕鏈可分為兩種，分別為kappa（κ）鏈和lambda（λ）鏈。據(jù)此，可將Ig分為兩型（type），即κ型和λ型。
Fig.1 抗體結構示意圖
隨著抗體藥物技術的不斷演進，抗體類型與分子結構日趨多樣化。
從傳統(tǒng)單抗（mAb）到雙抗（BsAb）、抗體偶聯(lián)藥物（ADC）、抗體寡核苷酸偶聯(lián)體（AOC）及多價抗體等新分子形式層出不窮。
這些分子在 Fc 結構、親和力、糖基化修飾及熱穩(wěn)定性 等方面存在顯著差異，
導致下游純化環(huán)節(jié)面臨新的挑戰(zhàn)：
• Protein A 結合差異增大：部分抗體或片段無法穩(wěn)定結合；
• 分子穩(wěn)定性更敏感：低 pH 洗脫易引發(fā)構象變化或聚集；
• 雜質性質更接近：片段、聚集體及錯配體在電荷、疏水性上與主峰相似，分離難度顯著增加；
• 工藝窗口更窄：對配基選擇、洗脫條件及清洗策略提出更高要求。
因此，開發(fā)兼顧高選擇性、溫和洗脫條件的親和層析工藝，成為抗體純化工藝優(yōu)化的關鍵方向。
抗體親和層析的原理
抗體親和層析（Antibody Affinity Chromatography）是利用生物分子間特異性相互作用實現(xiàn)高選擇性分離的經典方法。
最常用的配基為 Protein A——源自金黃色葡萄球菌的膜蛋白，可與抗體 Fc 區(qū)特異性結合，實現(xiàn)一步捕獲與高純化。
天然 Protein A 含五個 IgG 結合域，但也具有非特異結合片段，現(xiàn)代填料多采用基因改造型 Protein A，保留 Fc 結合功能的同時，顯著降低非特異吸附并增強其耐堿性。
此外，對于 Fab、IgM、抗體片段 等特殊分子，還可使用 Protein L（結合 κ 鏈）或 IgM 親和填料 進行特異分離。
核心原理：利用抗體與配基的高親和結合 → 非目標雜質洗脫 → 調整 pH 實現(xiàn)可逆洗脫。
親和填料選擇的關鍵要素
選擇合適的親和填料，是抗體純化工藝開發(fā)與產業(yè)化放大的核心環(huán)節(jié)。
優(yōu)秀的填料不僅要具備良好的分離性能，還需兼顧放大可行性、長期穩(wěn)定性與供應可靠性。
1.配基類型與結合特異性
不同親和配基識別的抗體結構位點不同，合適配基的選擇是實現(xiàn)高選擇性捕獲的基礎。
• Protein A：與抗體的 Fc 區(qū)結合，適用于 IgG1、IgG2、IgG4 及多數(shù) Fc 融合蛋白，是當前最主流的抗體捕獲配基；
• Protein L：識別 κ 輕鏈區(qū)域，適用于無 Fc 結構的抗體片段（如 Fab、scFv）或Fc改造后的抗體及部分 IgA、IgM；
• Protein G：結合范圍更廣，可作為 Protein A 的補充，用于特殊亞型或部分Fab的結合；
• IgM ：識別多聚結構域，能在高分子量條件下保持高選擇性分離。
不同抗體類型（IgG、IgM、IgA、雙抗、抗體片段等）需根據(jù)結合結構、亞型及分子特性匹配合適配基，才能獲得最佳純度與回收率。
下圖展示了抗體親和填料選擇流程圖（Fig.2），可幫助研發(fā)人員在早期開發(fā)階段快速判斷適用填料類型與推薦產品：
Fig.2 抗體親和填料選擇流程圖
2.動態(tài)結合載量（DBC）與分離平衡
DBC（Dynamic Binding Capacity）反映填料在特定流速與保留時間下的結合能力，是評價抗體捕獲效率的重要指標。
• DBC 高 → 捕獲通量提升、處理能力強，但可能導致分辨率下降或雜質共洗脫；
• DBC 低 → 分離效果好但通量不足。
工藝開發(fā)中需在載量、流速、收率與純度之間找到平衡點，綜合考慮分離效率與工藝的經濟性。
3.可放大性與壓力–流速性能
可放大性是衡量填料從實驗室到生產規(guī)模平穩(wěn)過渡能力的關鍵。
部分填料在小試階段表現(xiàn)良好，但放大后因機械強度不足或柱床壓縮，出現(xiàn)運行壓力上升、流速受限、柱床塌陷等問題，迫使客戶在中后期調整工藝或降低生產效率。
建議在早期開發(fā)階段就驗證填料的壓力–流速表現(xiàn)與可用線速度窗口，確保放大后依然滿足通量與運行壓力要求。
4.長期耐堿穩(wěn)定性
親和層析需經受反復NaOH在位清洗（CIP），耐堿性能直接決定填料使用壽命與生產成本。
高耐堿性填料可承受 0.5–1.0 M NaOH 清洗數(shù)百循環(huán)而保持載量與性能穩(wěn)定，是實現(xiàn)長期穩(wěn)定生產的關鍵。
5.批間一致性與供應穩(wěn)定性
在工業(yè)化階段，層析填料不僅是純化工藝的關鍵耗材，更是保證生產穩(wěn)定、可控的重要組成部分。
填料的質量批間一致性和穩(wěn)定供應直接影響工藝的穩(wěn)健運行與用戶終產品質量的一致性。
• 批間一致性：考察不同批次填料在關鍵性能等方面保持穩(wěn)定，以確保純化工藝在不同生產周期中具備良好的重復性和產品質量一致性。若批次差異過大，可能導致目標蛋白回收率波動、雜質譜變化或放大驗證失敗。
• 供應穩(wěn)定性：考察方向應不僅包含供應商持續(xù)、可靠的供貨能力，還應包括供應商在質量管理體系、生產產能、工藝一致性驗證及技術支持等方面的長期穩(wěn)定性。對于商業(yè)化生產企業(yè)而言，供應鏈的穩(wěn)定與可持續(xù)性是維持生產穩(wěn)定運行和風險可控的前提條件。
在親和填料篩選階段，應將產品的批間一致性與供應商的長期穩(wěn)定供貨能力納入綜合考量。
這不僅關系到物料性能的可重復性，也決定了工藝的穩(wěn)健性和最終產品的質量穩(wěn)定性。
應用案例：Novo-A Diamond 的溫和洗脫表現(xiàn)
在抗體純化中，低 pH 洗脫可能引起抗體構象變化和聚集。
使用 Novo-A Diamond 在 pH 4.0 條件下即可完全洗脫，純度 >94%，回收率 >95%，載量約 65 mg/mL（Fig.3）。
實驗條件：
層析柱：EzScreen 4.4 mL（Bed height = 10 cm）
樣品：mAb 原樣，樣品濃度6.8 mg/mL
Binding buffer: 20mM Tris-HCl, 0.15M NaCl, pH 7.2
Wash buffer 1: 20mM NaAc，1 M NaCl, pH 7.2
Wash buffer 2: 20mM Tris-HCl, pH 7.2
Elution buffer 1: 50mM NaAc-HAc, pH 4.0
Elution buffer 2: 50mM NaAc-HAc, pH 3.5
Fig.3 Novo-A Diamond單抗純化層析及電泳圖譜
結果表明：Novo-A Diamond 在溫和洗脫條件下仍具高捕獲能力，適合對低pH條件敏感抗體的純化。
總結
抗體親和層析是單抗及其衍生分子下游純化的關鍵環(huán)節(jié)，理想的親和填料應在 分離性能（DBC 與純度）、放大適配性（壓力–流速與耐堿性） 及供應保障（批間一致性與供應商能力）之間實現(xiàn)平衡。
在早期工藝開發(fā)階段充分評估這些維度，可有效避免后期因流速受限、配基衰減或供貨波動引起的工藝變更與驗證風險。
訂購與試用申請
| 產品名稱 | 規(guī)格 | 貨號 |
| AT Protein A Diamond Plus | 25mL | AA402305 |
| AT Protein A Diamond Ultra | 25mL | AA05701 |
| Novo-A Diamond | 25mL | AA05001 |
| Extrem A Diamond | 25mL | AA04501 |
| Diamond Protein L | 25mL | AA05101 |
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