2021年11月澳大利亞Victor Chang心臟研究所Richard P. Harvey團隊與Vaibhao Janbandhu等人合作在Cell Stem Cell上發表題目為“Hif-1a suppresses ROS-induced proliferation of cardiac fibroblasts following myocardial infarction”的心血管文章，該研究發現HIF-1a能夠抑制心肌梗死后ROS增加介導的心臟成纖維細胞增殖所致心肌纖維化擴張的現象。該發現為心血管疾病的治療提供了新的藥物靶點和研究方向。
缺氧誘導因子1(HIF-1)通路一直在心血管生物學領域中發揮重要作用。妊娠期生理性缺氧激活局部HIF-1通路，對心臟的腔室和室間隔形態發育至關重要。成人心臟經歷周期性的缺氧，包括生理上在高海拔和運動期間以及病理上在缺血期間、心肌細胞肥大、炎癥和纖維化期間的缺氧，這些情況可能與ROS水平升高和氧化損傷有關。
機體通過HIF-1通路適應缺氧微環境，HIF-1α屬于bHLH-PAS (basic-helix-loop-helix-Per-Arnt-Sim) 家族的轉錄因子。缺氧條件下HIF-1a亞基穩定并易位到細胞核，異二聚后激活下游基因通路，減少氧消耗和活性氧(ROS)生成，并恢復氧遞送。
HIF-1在心臟中的作用的研究主要集中在心肌細胞上，且其在ECM重構和缺血預適應以及動脈粥樣硬化進程中的作用已被證實。但HIF-1在心臟成纖維細胞中的功能尚未被闡明。心臟成纖維細胞是一種異質性的基質細胞群，通過控制細胞外基質的沉積和周轉來促進心臟的生物力學完整性，并介導心臟修復和再生中的適應性纖維化。心臟成纖維細胞幾乎與所有形式的心血管病理表型相關如：ECM分泌與收縮、纖維化與疤痕形成、心力衰竭等。
?
亮點要素
研究思路
-
通過對未損傷的小鼠S+P+陽性的CFs采用流式等分析，發現該種類細胞在缺氧狀態下的代謝更傾向于糖酵解途徑而非常規的線粒體氧化磷酸化途徑，由此發現CFs不同于CMs的代謝譜差異。（現象挖掘）
-
HIF-1a在缺氧狀態下CFs中高表達，其靶基因能在正常的氧化磷酸化中促進糖酵解途徑，通過scRNA-seq結果與HIF-1靶基因數據庫的比對確定HIF-1的靶基因是同樣在缺氧CFs中高表達的MEIS1。（鎖定目標）
-
體外利用與CFs類似的cCFU-Fs成纖維細胞系，驗證線粒體質量低的細胞具有和CFs類似的增殖能力；體內構建CFs特異性Hif-1a敲除小鼠驗證其在CFs穩態和心臟疾病中的作用。（體內外驗證）
-
通過整理并利用qRT-PCR逐一驗證與HIF-1相關的機制如糖酵解、血管生成、氧化還原穩態等，最終將HIF-1作用機制確定為調節線粒體氧化應激。（關聯機制驗證）
-
通過ROS探針等驗證在缺氧CFs中HIF-1α調節氧化應激降低線粒體ROS，進而抑制由ROS介導PI3K/AKT/mTOR及MAPK、ERK1/2等通路激活導致的CFs增殖。（機制串聯）
?
研究內容
首先分離正常小鼠心臟中 SCA1+/PDGFRa+/CD31-的CFs，在低氧狀態下通過Pim染色流式分析發現S+P+細胞缺氧程度高于其他非心肌細胞群，其氧消耗及ATP水平遠低于其他非心肌細胞群。但其葡萄糖消耗速率及細胞內乳酸水平卻更高，提示S+P+細胞的代謝更傾向于糖酵解途徑而非常規的線粒體氧化磷酸化途徑，與之相對應的S+P+細胞的線粒體質量同樣偏低。HIF-1a及其靶基因在S+P+細胞中高表達，已知HIF-1a的靶基因能在氧化磷酸化中促進糖酵解，隨后通過已發表的scRNA-seq結果與HIF-1靶基因數據庫的比對確定HIF-1a的靶基因MEIS1。又進一步對線粒體質量差異的細胞進行增殖能力的對比，發現低線粒體質量的細胞增殖能力更強，這也與缺氧狀態下CFs的增殖現象相符合。
圖1.成年小鼠心臟中S+P+細胞的代謝譜
為了探索HIF-1a在心臟成纖維細胞穩態和疾病中的作用，研究者構建了CF特異性HIF-1a他莫昔芬誘導的條件性敲除小鼠并對其心臟中CF進行測序。發現cKO小鼠下調的差異基因與發表的HIF-1靶基因存在交集，且GOterm分析顯示，HIF-1相關靶點參與了增殖等細胞功能的調控，其他少數上調的基因與炎癥、蛋白水解和應激等途徑有關。接下來為了研究cKO小鼠在心臟損傷后CFs的增殖情況，研究者構建了心肌梗死模型并利用EdU追蹤增殖細胞。MI手術3天時在梗死區觀察到EdU+細胞，7天時延伸至梗死邊界區，而譜系陰性小鼠無變化。提示CFs中Hif-1a的缺失可導致心肌梗死后成纖維細胞增殖增加。
圖2.心肌梗死后hif-1a缺失的CFs的增殖能力有缺陷
對MI及假手術第3天的cKO小鼠心臟成纖維細胞進行scRNA-seq測序，發現假手術組cKO小鼠CFs同樣存在激活現象，驗證了CFs存在全身因素的敏感性。測序的另一發現是成纖維細胞前體減少，代表損傷的中間體和激活體增加，證明更多的CF進入細胞周期。同時由于中間體和激活體增多，相關的蛋白合成基因上調，編碼細胞信號傳導負調控因子的基因下調，導致CF開始增殖。對心肌梗死后第14天的cKO小鼠左心室進行qPCR，發現細胞外基質、重構蛋白酶和纖維化介質相關基因顯著上調，證明心臟纖維化反應增加。
圖3.HIF-1a缺失的CFs在心梗后重入細胞周期并加重心梗后纖維化
為了更直觀的展現cKO小鼠CFs的動態，研究者運用前沿3D技術構建了3D工程化心肌微組織。體外培養顯示cKO小鼠CFs顯著擴張并伴隨著膠原沉積，但并不影響心肌組織的面積。隨后又探究了3D心臟體系CFs動作電位的傳導情況，與WT相比cKO心臟束的傳導速率較慢、動作電位持續時間更長，并表現出收縮力的損害。cKO小鼠CFs在這種缺乏血管、免疫和其他心肌細胞類型的簡單3D體系中的影響與體內研究基本一致。
圖4.Hif-1a缺失的CFs在體外顯著惡化了3D心肌束的電位傳導和機械力
機制研究，在應對缺氧時，Hif-1a通過確保有效利用現有的氧氣和能量底物，同時最小化線粒體氧化應激來調節代謝。研究者對MI術后第1天純化的cKO小鼠CF進行qRT-PCR檢測，發現與糖酵解、血管生成和氧化還原穩態有關的HIF-1靶基因的表達顯著降低。鑒于心肌梗死后cKO心臟中控制氧化還原穩態的HIF-1a靶點下調有助于減少線粒體ROS，并且已知正常生理產生的ROS可以作為干細胞/祖細胞增殖和分化的信號。研究者大膽假設ROS的增加是cKO小鼠CFs增殖和纖維化增加的原因并進行驗證，線粒體特異性ROS探針證明梗死后的ROS增加定位于線粒體中并伴隨CF的顯著增殖。接下來利用線粒體氧化劑MitoPQ（ROS促進劑）在體處理后CF顯著增殖，而線粒體抗氧化劑MitoT（ROS抑制劑）治療后CF增殖及總數均減少。已有研究表明，ROS與PI3K/AKT/mTOR、MAPK、ERK1/2通路的激活有關。MitoT處理后，心梗cKO小鼠的CF中pERK1/2和pAKT降低到與心梗WT小鼠相同的水平。這些數據證明了ROS與AKT和ERK1/2信號通路的關系及其在CF增殖中作用機制。
圖5.Hif-1a介導的氧化還原調節控制心肌梗死后CFs的增殖
通過研究線粒體抗氧化劑MitoT為未來心臟病治療提供解決思路。MI術后28天的小鼠心臟瘢痕面積增加、活心肌體積減少。MitoT的治療挽救了心梗cKO小鼠的心臟心室重構、CF增殖及ECM擴張。心臟超聲顯示MI術后第7天和第28天，cKO小鼠心臟功能明顯惡化，包括面積變化減少、左室射血分數和心輸出量減少，左室收縮末期和舒張量增加。cKO-MI小鼠的心重體重比也顯著升高，體現出CF增殖及ECM的擴張。MitoT的治療能夠逆轉不良的心功能參數和HW/BW比值并使其恢復到WT小鼠MI術后心臟相似的水平，該發現或可為心臟病治療研究提供新的思路。
圖6.MitoT治療挽救了心肌梗死后cKO小鼠的心臟結構和功能缺陷
和元生物具有多年豐富的動物實驗和心血管動物模型構建的實操經驗，并兼具出色的基因操作與病毒構建等技術。同時依托公司的檢測平臺、病理平臺、細胞平臺等專業實驗平臺，可為您提供從心血管動物模型到基因干預、病理檢測、細胞功能學研究等一站式心血管研究服務體系，您可體驗文中涉及到的心血管前沿研究手段與支持。歡迎掃描下方二維碼了解更多實驗服務詳情。