2013年，Broad研究所的張峰和Eric S. Lander兩個研究團(tuán)隊，同時在Science中發(fā)表了CRISPR-Cas9的文庫應(yīng)用，首次把這項技術(shù)暴露在了公眾視野中。隨著科研軟實力和CRISPR-Cas9體系開放性的不斷增加，在2017年后文庫篩選已經(jīng)成為了一種主要的差異基因發(fā)掘工具。但是目前仍然有很多人不知道文庫的具體的實驗方式及應(yīng)用場景。
2022年3月25日，Julia Joung等人在Nature Communications發(fā)表“CRISPR activation screen identifies BCL-2 proteins and B3GNT2 as drivers of cancer resistance to T cell-mediated cytotoxicity”，文中借助CRISPR-Cas9文庫篩選技術(shù)開展腫瘤研究。本文以此為例，分析CRISPR-Cas9文庫的研究思路。
1 技術(shù)思路
（1）通過CRISPR-Cas9激活文庫確定惡性黑色素瘤細(xì)胞A375中與免疫耐受相關(guān)的相關(guān)基因，并通過MAGeCK與現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)果分析后，確定4個候選基因，為CD274、MCL1、JUNB、B3GNT2。（差異基因篩選）
（2）首先，分別構(gòu)建CD274、MCL1、JUNB、B3GNT2 4個基因的過表達(dá)細(xì)胞株。然后在體外，通過CTG法（CellTiter-Glo）檢測NY-ESO-1 CAR-T細(xì)胞對4株過表達(dá)細(xì)胞及對照細(xì)胞的殺傷能力差異。在體內(nèi)，使用NGS小鼠皮下移植瘤模型，證明4株過表達(dá)細(xì)胞及對照細(xì)胞對于尾靜脈過繼NY-ESO-1 CAR-T細(xì)胞的響應(yīng)性差異。（基因表型驗證）
（3）通過Caspase-8活性檢測、流式檢測、CHIP-seq及RNA-seq等方法，證明MCL1和JUNB基因通過影響線粒體凋亡信號通路去抵抗FasL和TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。（機(jī)制證明）
（4）通過細(xì)胞因子分泌檢測及COIP等實驗證明B3GNT2基因主要通過影響腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞的受體配體結(jié)合發(fā)揮免疫耐受功能。（機(jī)制證明）
（5）構(gòu)建4個差異基因敲低腫瘤細(xì)胞株，反向驗證是否有免疫增敏效果。同時用小分子抑制劑證明基因正確性。（多向驗證）
2 研究內(nèi)容
作者通過首先制備CRISPR-Cas9激活文庫，然后構(gòu)建NY-ESO-1抗原高表達(dá)的文庫細(xì)胞株，繼而與NY-ESO-1的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，通過瞬時殺傷和長效殺傷的兩種篩選方式進(jìn)行篩選，將篩選后的樣本通過CRISPR-Screen進(jìn)行差異基因初步篩選。在篩選好的差異基因與公共數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對后，確定明顯差異表達(dá)的CD274、MCL1、JUNB、B3GNT2 4個基因進(jìn)行后續(xù)研究。
TIP1：好的開始是成功的一半啊，集美們，一定要用新穎的技術(shù)，結(jié)合已有的公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合的基因發(fā)掘工作啊。
基于表達(dá)NY-ESO-1抗原的人黑色素瘤細(xì)胞A375構(gòu)建CD274、MCL1、JUNB、B3GNT2基因過表達(dá)腫瘤細(xì)胞，在體外與NY-ESO-1 CAR-T細(xì)胞共培養(yǎng)，后用CTG法檢測各個過表達(dá)細(xì)胞株與對照細(xì)胞株的存活細(xì)胞之差，證明4個基因過表達(dá)后會降低CAR-T細(xì)胞的殺傷活力。
步驟2中的過表達(dá)和對照構(gòu)建NGS小鼠，皮下腫瘤模型，成瘤后尾靜脈過繼CAR-T細(xì)胞，實驗證明，過表達(dá)腫瘤對CAR-T細(xì)胞的治療響應(yīng)性更差，小鼠生存期更短。
已有研究表明，JUNB是一種轉(zhuǎn)錄因子，并且能夠影響NKG2D配體，從而影響NK細(xì)胞的正常殺傷功能，而MCL1更是在早期的研究中就發(fā)現(xiàn)與FASL和TRAIL受體功能相關(guān)，因此作者也受其思路啟發(fā)，從受體方面入手驗證。過表達(dá)和對照用流式檢測FASL和TRAIL受體的表達(dá)量，確定過表達(dá)JUNB和MCL1后，會影響受體表達(dá)；JUNB和MCL1過表達(dá)細(xì)胞用 FasL 或TRAIL處理后，檢測Caspase-8的活性，發(fā)現(xiàn)JUNB的作用會被扭轉(zhuǎn)，因此也確認(rèn)JUNB是通路下游非常重要的一環(huán)；隨后通過CHIP-seq和RNA-seq兩種技術(shù)，證明JUNB直接調(diào)控的基因是NFKB，并且能夠通過操控NFKB來影響下游信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，至此，完美解釋了JUNB基因影響免疫耐受的環(huán)路，而MCL1并不影響前端的受體表達(dá)，因此作者證明它是直接調(diào)控了線粒體凋亡相關(guān)的BAX和BAK發(fā)揮功能。
TIP2：再次證明，多讀文章有多重要啊集美們，不要光是天天買買買，一定要看文獻(xiàn)啊，當(dāng)我們的實驗有了系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)和支持，才有了攀登高分文章階梯的登山杖。
至于B3GNT2基因，目前已知它可以編碼β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶 ，因此作者合理推測此基因影響多聚乳糖胺合成，并且目前已經(jīng)有其他研究結(jié)果隱約指明了這一證據(jù)。作者在補充實驗中已經(jīng)通過番茄凝集素檢測實驗證實B3GNT2過表達(dá)細(xì)胞胞內(nèi)和胞外中多聚乳糖胺含量都有所增加，而這一現(xiàn)象，是由于B3GNT2誘導(dǎo)的N-糖基化修飾和O-糖基化修飾有關(guān)。作者以此作為起點，通過細(xì)胞因子分泌實驗和CTG細(xì)胞活力證明，在傳統(tǒng)的共培養(yǎng)體系中，持續(xù)加入N-糖基化修飾抑制劑KIF，能夠扭轉(zhuǎn)B3GNT2過表達(dá)帶來的免疫耐受；通過COIP實驗B3GNT2過表達(dá)之后番茄凝集素對于各類腫瘤細(xì)胞表面受體結(jié)合能力大幅提升，這也支持了作者的假說。
最后當(dāng)然多項驗證了，首先作者先在表達(dá)HER2抗原的SW1417細(xì)胞中敲低CD274、MCL1、JUNB、B3GNT2 這4個基因，然后通過與HER2 CAR-T細(xì)胞共培養(yǎng)驗證基因的有效性和廣泛性，后續(xù)在多種腫瘤細(xì)胞中證實N糖基化修飾抑制劑KIF和MCL1小分子抑制劑S63845的功能，從另一角度證明了基因功能，并且為臨床應(yīng)用打開思路。
TIP3：強(qiáng)調(diào)一點，對于腫瘤研究來說，盡量一定要回歸臨床，當(dāng)我們的研究有了一定的臨床指導(dǎo)意義，我們才好發(fā)文章啊。
綜上所述，這篇文章系統(tǒng)的向我們展示了，如何用CRISPR-Cas9文庫發(fā)掘差異基因及后續(xù)實驗驗證的全套過程。文章涵蓋了文庫篩選及腫瘤免疫兩個領(lǐng)域內(nèi)研究熱點，在選題方面可以說是羚羊掛角，不負(fù)高分期刊之名，值得我們深入學(xué)習(xí)和參考。