在RT-QPCR實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，但獲得的cDNA，大家通常會(huì)用Nanodrop來測定其濃度和純度，這樣正確嗎？得到的cDNA是否存在基因組DNA（gDNA）污染從而影響后續(xù)的qPCR實(shí)驗(yàn)?zāi)兀楷F(xiàn)在就為大家解讀一下。
cDNA不需要用Nanodrop測量濃度和純度
為什么逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA不需要用Nanodrop來檢測濃度與純度呢？因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物是一個(gè)混合體系（含有cDNA、未完全逆轉(zhuǎn)錄的RNA、dNTP、殘余的引物以及各種蛋白和鹽離子等成分），會(huì)干擾cDNA的吸光度。此外，260 nm是核酸吸收峰最高的位置，在這個(gè)位置，1 OD（optical density，光密度）的吸光度分別相當(dāng)于50 ng/μL的雙鏈DNA，37 ng/μL的單鏈DNA，40 ng/μL的RNA，30 ng/μL的寡核苷酸（dNTP）。因此，就dNTP而言，即使cDNA濃度一樣，dNTP也會(huì)嚴(yán)重干擾其測定結(jié)果。
為此，我們專門進(jìn)行了驗(yàn)證，以進(jìn)一步說明dNTP 投入量對(duì)cDNA濃度檢測結(jié)果存在的影響。以小鼠肌肉組織RNA為模板，采用不同品牌試劑分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，RNA 投入量為500 ng，逆轉(zhuǎn)錄體系及程序分別按各自說明書進(jìn)行。采用Nanodrop測定cDNA濃度，并取相同體積cDNA分別進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明：不同品牌逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品的cDNA濃度相差較大，但定量實(shí)驗(yàn)Ct值幾乎一致。逆轉(zhuǎn)錄體系中dNTP 投入量的多少會(huì)使cDNA濃度的測定結(jié)果產(chǎn)生較大差異，但最終Ct值幾乎一致。
圖1.qPCR檢測結(jié)果△Ct＜1，且 Ct 值與 Nanodrop 定量結(jié)果無線性關(guān)系
因此，cDNA濃度的測定值是不準(zhǔn)確的，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)之后無需測定濃度。RT-qPCR是一個(gè)多步驟連貫實(shí)驗(yàn)，正是因?yàn)閏DNA無法鑒定，只能通過后續(xù)qPCR實(shí)驗(yàn)才能呈現(xiàn)結(jié)果。
gDNA污染的識(shí)別與去除
gDNA的污染主要來源于RNA模板， 那如何識(shí)別RNA模板中是否仍含有g(shù)DNA殘留呢？可以在逆轉(zhuǎn)錄之前將RNA模板進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。如下圖所示，泳道上部有明顯的高分子雜帶，則可能有g(shù)DNA的殘留，不建議用于后續(xù)的qPCR實(shí)驗(yàn)，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性造成影響。
圖2. 高質(zhì)量RNA（左）和RNA中有g(shù)DNA（右）
如果逆轉(zhuǎn)錄前沒有確認(rèn)模板中是否含有g(shù)DNA，可以在qPCR實(shí)驗(yàn)中設(shè)立NRC陰性對(duì)照組（以未逆轉(zhuǎn)錄的RNA作為模板）驗(yàn)證，如果NRC具有明顯的擴(kuò)增，表明RNA中可能含有g(shù)DNA污染。
那么該如何去除gDNA污染呢？通?？梢栽赗NA提取時(shí)或逆轉(zhuǎn)錄前用DNA酶或gDNA清除劑去除gDNA。為此，Arcegen提供了1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA digester plus, for qPCR)（Cat#N132061）可有效去除逆轉(zhuǎn)錄過程中g(shù)DNA的殘留。
產(chǎn)品推薦
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應(yīng)用類型 |
產(chǎn)品名稱 |
貨號(hào) |
規(guī)格 |
目錄價(jià) |
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反轉(zhuǎn)錄 |
1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA digester plus, for qPCR) 一鏈cDNA合成反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液（含gDNA消化，用于qPCR）
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N132061E |
10 T |
100.00 |
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N132061S |
100 T |
900.00 |