疾病機理
? ? ? ?帕金森病（Parkinson’s disease, PD)又名震顫麻痹，是一種常見的中老年人神經系統變性疾病。主要病變在黑質和紋狀體。震顫、肌強直及運動減少是本病的主要臨床特征。帕金森病是老年人中第四位最常見的神經變性疾病。PD疾病形成的主要標志是多巴胺能神經細胞（DAG細胞）的損傷和路易小體的形成。
造模方法
1）外周或腦內注射MPTP
? ? ? ?MPTP（1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶，1-Methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine）本身不帶有神經毒性但有很強的的親脂性，進入腦后先被腦內細胞線粒體外膜的MAO-B（單胺氧化酶B）催化變成中間產物MPDP+，再很快產生自發氧化迅速變成有神經毒性的MPP+。通過外周或腦內注射MPTP可以達到中腦內DAG神經細胞大量凋亡的效果，模擬了人PD疾病。根據每次注射劑量，間隔時間，方式及時間長短的不同，可以制成用于不同研究目的的各種大小鼠模型。
? ? ? ?1.急性模型：腹腔或皮下注射MPTP，每次間隔1~2h，連續4次。建模速度快，損傷嚴重。不符合人類PD患者的慢性發病機制，其損傷是大部分神經元快速損傷壞死而非慢性的凋亡，模型死亡率高。
? ? ? ?2.亞急性模型：腹腔或皮下注射MPTP，每天1次，連續5~10天。成活率較高，損傷沒有急性嚴重，DAG神經元部分凋亡，但是和人類發病機制仍有差異。MPTP模型對動物損傷是可逆的，可短期產生神經毒性，不是長期神經退行性變化。
? ? ? ?3.慢性模型：腹腔或皮下注射MPTP，每周兩次或3.5天一次，連續10次。死亡率非常低，模型穩定，過程穩定不易恢復，DAG神經元凋亡表現緩慢且為漸進過程，與人類PD病程相似。
2）紋狀體-黑質系統中注射6-OHDA
? ? ? ?6-OHDA（6-羥基多巴胺）是兒茶酚胺的羥基化衍生物，其結構與兒茶酚胺類似，是特異性的神經毒素，不能通過血腦屏障，腦注射6-OHDA可以造成中樞神經系統損傷。注射位置為紋狀體-黑質系統。損傷機制為抑制線粒體呼吸鏈的功能，6-OHDA能直接抑制線粒體呼吸酶復合體Ⅰ（NADH脫氫酶）和復合體Ⅳ（細胞色素氧化酶）活性，從而抑制線粒體酶呼吸鏈的功能，導致細胞內ATP耗盡，引起細胞死亡。
? ? ? ?1.“完全”損傷模型：大鼠腦立體定位注射，位置MFB（內側前腦束）。
? ? ? ?2.“部分”損傷模型：大鼠腦立體定位注射，位置MFB。
? ? ? ?3.部分紋狀體損傷模型：大鼠腦立體定位注射，位置紋狀體。
? ? ? ?6-OHDA模型制作過程靈活，可以根據客戶需求選擇損傷程度、注射位置（紋狀體，MFB或黑質）及注射劑量。6-OHDA注射后15分鐘即可檢測到DA（多巴胺）含量的下降，3~5天內注射位置絕大多數神經元死亡，損傷嚴重。
實例：
? ? ? ?動物：雄性SD大鼠；雄性5-8周齡C57/BL6小鼠
? ? ? ?6-OHDA建立嚙齒動物半帕金森模型
? ? ? ?地昔帕明腹腔注射到嚙齒動物體內，30min后，根據立體定向坐標（小鼠左紋狀體，AP，ML，DV；大鼠MFB，AP，ML，DV）將6-OHDA[小鼠取2μl；大鼠取3μl，溶解于0.2%（w/v）抗壞血酸（AA）]注入左紋狀體或MFB一側，微量注射泵控制微量注射器（5μl）速率為0.1μl/min。注射后，將注射器留在原位5 min以避免回流。注射6-OHDA后兩周（小鼠）或三周（大鼠），進行阿撲嗎啡（APO，0.5 mg/kg）誘導的旋轉試驗，以評估建立半帕金森嚙齒動物模型是否成功。注射阿撲嗎啡3分鐘后人工記錄旋轉次數，在后續研究中選擇10分鐘內旋轉次數超過40次的嚙齒動物。在所有實驗之后，用酪氨酸羥化酶（TH）免疫染色法評估SNc中多巴胺能神經元的丟失。
圖1. 小鼠PD造模后行為評估
? ? ? ?平衡木實驗中小鼠通過平衡木的時間明顯延長；APO誘導的旋轉實驗中小鼠每分鐘旋轉次數大于4，表明6-OHDA建立小鼠半帕金森模型成功。
MPTP建立小鼠半帕金森模型
? ? ? ?用注射泵控制的微量注射器（5μl）以0.1μl min-1的速率將2μl MPTP（溶于生理鹽水）注射到左紋狀體（AP，ML，DV）。注射后，將注射器留在原位5 min以避免回流。旋轉次數計算為注射APO后10分鐘內的同側旋轉－對側旋轉。
? ? ? ?參考文獻：
? ? ? ?Zhang H, Zhang C, Qu Z, et al. STN-ANT plasticity is crucial for the motor control in Parkinson's disease model. Signal Transduct Target Ther. 2021 Jun 9;6(1):215.（客戶文章）
3）通過病毒載體在黑質過表達α-Synuclein造PD模型（我司開發）
? ? ? ?α-突觸核蛋白（a-Synuclein）是一種在中樞神經系統突觸前及核周表達的可溶性蛋白質，它與帕金森病的發病機制和功能障礙密切相關，是路易小體的主要組成部分。應用腦立體定位技術向大鼠中腦黑質區分別注入攜帶α-synuclein野生型（WT）與突變型（A30P，A53T）序列的rAAV9X型病毒，并在相應部位實現基因過表達，從而建立PD大鼠模型，并從行為學（ethology）及組織病理、生化角度對該模型進行評價。
? ? ? ?雌性8周齡wistar大鼠64只，體重200~250g；根據注射的不同種病毒分為A/B/C/D共4組，每組16只。每組按照遞增的注射劑量分為Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ四組，每種劑量注射4只。注射后2周，4周時各處死2只進行切片免疫組化成像。結果表明，Ⅳ組表達效果更好。注射后第4，7，10，12周進行走步實驗和上肢放置實驗等行為學檢測，結果表明模型構建成功。
? ? ? ?Fig.1A.注射GT-0069 SYN-EGFP病毒2w、4w后的免疫組化成像；B.注射GT-0070 SYN-SNCA(WT)病毒2w、4w后的免疫組化成像；C.注射GT-0071 SYN-SNCA(A30P)病毒2w、4w后的免疫組化成像；D.注射GT-0072 SYN-SNCA(A53T)病毒2w、4w后的免疫組化成像。
? ? ? ?隨后再進行行為學檢測實驗。對四組大鼠右側黑質注射同一劑量4種病毒，注射后第4，7，10，12周進行走步實驗和上肢放置實驗等行為學檢測，結果表明模型構建成功（Fig.2）。
? ? ? ?Fig.2A.大鼠走步實驗數據統計。其中70組為注射SNCA野生型(WT)，71組為突變型A30P，72組為突變型A53T，69組為EGFP對照組。分別對應注射的病毒編號為GT-0069，GT-0070，GT-0071和GT-0072。B.大鼠上肢放置實驗數據統計。
我司優勢
? ? ? ?◆靶向特異腦區。
? ? ? ?◆可以在成年動物中進行轉基因表達（避免發育階段中代償機制的影響）。
? ? ? ?◆可以制備不同劑量，不同物種（嚙齒動物，非人靈長類動物均可）和不同基因組合的疾病模型。
? ? ? ?◆有時間依賴性的神經病理改變（神經炎癥放大和細胞質內含物）。
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