引言
? ? ? ?在過去十年的研究過程中，基因傳遞到中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)（CNS和PNS）的進步極大地促進了神經(jīng)科學(xué)的研究進展，并有可能將相關(guān)的研究成果推向臨床，為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供新的療法。然而，跨物種的非侵入性基因遞送方式的研究空白，極大地限制了神經(jīng)科學(xué)相關(guān)研究向臨床的轉(zhuǎn)化。
? ? ? ?在病毒載體遞送基因的相關(guān)研究中，最有臨床轉(zhuǎn)化潛力的是腺相關(guān)病毒（AAV），AAV具有高穩(wěn)定性、長期表達和低免疫原性的特點，深受神經(jīng)科學(xué)工作者的喜愛。但是大部分AAV均需要通過侵入性手術(shù)的方式進行注射，并且由于血腦屏障的存在，通過靜脈注射的AAV基本上不能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)表達。最新的研究成果發(fā)現(xiàn)AAV-PHP.eB可以高效的通過血腦屏障，將基因遞送到中樞系統(tǒng)；而AAV-PHP.S則偏向于表達在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，但是這兩類病毒載體僅在小鼠中起效。
? ? ? ?對于非人靈長類動物模型的基因遞送手段的缺乏，嚴(yán)重地制約了基礎(chǔ)研究向臨床研究的轉(zhuǎn)化進程。而基因治療在解決與中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的神經(jīng)病理學(xué)方面具有巨大的前景。因此開發(fā)跨物種的有效和非侵入性基因傳遞載體是一個迫切需求。研究人員需開發(fā)出一類跨物種在嚙齒類動物和非人靈長類動物中穩(wěn)定性表達，并且透過血腦屏障的AAV載體，這將有利于推進基因治療的臨床前研究。
? ? ? ?加州理工學(xué)院Chen X等人進化出一個AAV9衣殼變體家族，包括MaCPNS1和MaCPNS2。嚙齒類動物（小鼠和大鼠）中系統(tǒng)注射AAV-MaCPNS1或AAV-MaCPNS2即可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)PNS，并能解析PNS功能和無創(chuàng)調(diào)控PNS。另外，這兩種載體還可以有效地將基因同時傳遞到非人靈長類動物（恒河猴和狨猴）的PNS和CNS。
結(jié)果
01
跨物種并且透過血腦屏障的病毒衣殼的開發(fā)
? ? ? ?為了制備衣殼多樣化的病毒載體，作者通過在AAV9衣殼位點A588到589之間隨機插入一個七肽，來制備多樣性的AAV9病毒衣殼。之后將制備的病毒載體通過尾靜脈的方式，注射到不同品系的轉(zhuǎn)基因鼠中，篩選出能感染神經(jīng)元的病毒衣殼。通過兩輪篩選，研究人員從6300個變體中篩選出具有神經(jīng)元噬性的病毒衣殼，隨后通過UMAP算法（uniform manifold approximation and projection algorithm；統(tǒng)一流形近似與投影）鑒定出2個高選擇性在外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達的新的病毒衣殼AAV-MaCPNS1和AAV-MaCPNS2。
圖1. AAV-MaCPNS1/2的開發(fā)過程
02
AAV-MaCPNS1/2感染嚙齒類動物的外周神經(jīng)系統(tǒng)
? ? ? ?目前基礎(chǔ)研究使用的病毒載體中，特異性干預(yù)外周神經(jīng)系統(tǒng)的載體并不多見，AAV-PHP.S基本是唯一的選擇。為了測試AAV-MaCPNS1/2對外周神經(jīng)系統(tǒng)的噬性，研究人員通過尾靜脈注射將AAV-PHP.S、AAV-MaCPNS1和AAV-MaCPNS2注入小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)在尾靜脈注射相同病毒劑量的情況下，AAV-MaCPNS1/2在外周神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)狀神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié)和腸神經(jīng)元的表達均比AAV-PHP.S高出2倍以上。體現(xiàn)出AAV-MaCPNS1/2在感染嚙齒類動物外周系統(tǒng)的優(yōu)越性。
圖2. AAV-MaCPNS1/2在結(jié)狀神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié)的表達效果優(yōu)于AAV-PHP.S
? ? ? ?既然AAV-MaCPNS1/2在嚙齒類外周神經(jīng)系統(tǒng)有優(yōu)越的表達特性，那么有沒有可能結(jié)合遺傳改造手段監(jiān)測和干預(yù)外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元呢？研究人員將基因編碼的鈣指示劑（GECI-jGCaMP8s）的相關(guān)元件整合到AAV-MaCPNS1（尾靜脈注射），發(fā)現(xiàn)在腸道注入葡萄糖后，能監(jiān)測到結(jié)狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元活性變化。同樣的將化學(xué)遺傳學(xué)激活元件[DIO-HM3D(Gq)]整合到AAV-MaCPNS1（尾靜脈注射），使用CNO激活DREADD后，在TRPV1（感受溫度和疼痛的離子通道蛋白）-Cre小鼠上檢測到明顯的疼痛樣行為（激活背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1+神經(jīng)元）。體現(xiàn)出AAV-MaCPNS1在監(jiān)測和調(diào)控外周神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)研究中的優(yōu)越性。
圖3. 尾靜脈注射AAV-MaCPNS1激活背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1+神經(jīng)元引起疼痛
03
AAV-MaCPNS1/2感染非人靈長類動物外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)
? ? ? ?為了研究靜脈注射AAV-MaCPNS1/2在非人靈長類動物中的表達效率。研究人員通過尾靜脈注射將AAV-MaCPNS1/2注射到狨猴和恒河猴的體內(nèi)，以臨床研究喜愛使用的AAV9作為對照組。發(fā)現(xiàn)AAV9在背根神經(jīng)節(jié)和腸神經(jīng)處不表達，而AAV-MaCPNS1/2穩(wěn)定表達。此外AAV-MaCPNS1/2在中樞系統(tǒng)的表達效率是AAV9的數(shù)十倍以上，包括脊髓、皮層、丘腦、小腦、腦干等多個腦區(qū)。體現(xiàn)出AAV-MaCPNS1/2在非人靈長類動物的外周表達和中樞表達的優(yōu)越性。
圖4. AAV9和AAV-MaCPNS1/2在狨猴背根神經(jīng)節(jié)和小腸的表達
圖5. AAV9和AAV-MaCPNS1/2在狨猴大腦不同區(qū)域的表達
結(jié)論
? ? ? ?總而言之，本文通過定向進化的手段獲得AAV-MaCPNS1/2兩類病毒衣殼，該病毒填補了嚙齒類動物的外周神經(jīng)系統(tǒng)監(jiān)測和干預(yù)手段的空白，并且通過靜脈注射在非人靈長類動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)有良好的表達特性，極具基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化價值。
圖6. 總結(jié)圖. AAV-MaCPNS1/2在嚙齒類動物和非人靈長類動物的表達情況
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