1模型簡介
膿毒癥（sepsis）是指由感染引起的機體器官功能障礙并且伴有多種細胞因子和炎性介質(zhì)的誘導(dǎo)、合成和釋放的綜合癥。
其發(fā)病機制異常復(fù)雜，可進一步轉(zhuǎn)變?yōu)槟摱拘孕菘?、嚴重膿毒癥 ，也是導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征（ MODS ）的重要原因。
2造模方法
造模方式
目前的各類文獻報道中的常見的膿毒癥模型有：
（1）內(nèi)毒素（LPS）模型
（2）盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）模型
（3）結(jié)腸支架植入腹膜炎（CASP）
（4）大腸桿菌輸注的膿毒癥模型
（5）植入充滿細菌的蛋白凝塊
（6）肺炎誘導(dǎo)膿毒癥模型
造模方法
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模型 |
內(nèi)毒素（LPS）模型 |
盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）模型 |
肺炎誘導(dǎo)膿毒癥模型 |
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造模方式 |
通過腹腔注射細菌的致病成分內(nèi)毒素 |
盲腸結(jié)扎穿孔，造成少量糞便持續(xù)流入腹腔導(dǎo)致腹腔感染 |
通過呼吸道給藥、噴藥等誘導(dǎo)肺炎，進一步誘發(fā)膿毒癥 |
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臨床適應(yīng)癥 |
可以重現(xiàn)臨床膿毒癥模型中體溫過低、呼吸急促、心動過速、 低血壓的臨床表現(xiàn) |
準確地模仿臨床腸道穿孔后造成的膿毒癥及膿毒癥相關(guān)休克 |
這是一個臨床相關(guān)的模型，更加貼合臨床的膿毒癥 |
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優(yōu)勢 |
具有穩(wěn)定性、 重復(fù)性、可控性強 |
相對簡單、 可重復(fù)使用 |
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劣勢 |
短暫的內(nèi)毒素輸入會導(dǎo)致動物快速耐受或死亡，且成本較高 |
死亡率比較高、需要嚴格把控實驗中導(dǎo)致死亡的因素或操作 |
氣管內(nèi)給藥或支氣管內(nèi)給藥需要麻醉，可能會影響免疫反應(yīng)的發(fā)展 |
操作方法（盲腸結(jié)扎穿孔）
①動物分組：C57BL/6雄性小鼠（25-30g），動物適應(yīng)性生長一周，隨機分為2組，對照組和模型組，模型組采用盲腸結(jié)扎穿刺法，對照組做開腹、縫合處理。
②用異氟烷麻醉小鼠，用電動剃毛刀取出腹部毛發(fā)，并用碘伏對該區(qū)域進行消毒。
③用手術(shù)刀縱向切開皮膚中線，識別腹部肌肉組織的白線（中間的白色筋膜），并對其進行肌間切開和筋膜層和腹膜層的切開，使用鈍解剖鉗定位盲腸，分離盲腸并將其外部化，將小腸和大腸的其余部分留在腹膜腔內(nèi)，在大多數(shù)情況下，盲腸位于腹部左側(cè)。切口也可選在左側(cè)髖關(guān)節(jié)處往上的位置。
④在指定位置對盲腸進行結(jié)扎，已獲得所需的嚴重程度等級。
⑤盲腸穿刺前，將盲腸內(nèi)容物輕輕推向盲腸遠端，在盲腸穿刺時，輕輕吸出任何截留的空氣或氣體。在結(jié)扎和盲腸尖端之間的中間，在腸系膜到反腸方向上，通過單穿和全穿的方式對盲腸進行穿孔。
⑥拔出針頭后，從腸系膜和抗腸系膜穿透孔中擠出少量（液滴）糞便，以確保通暢。
⑦將盲腸重新定位到腹腔中，而不會將盲腸中的糞便擴散到腹壁傷口邊緣。
⑧通過簡單的連續(xù)縫合閉合腹膜、筋膜和腹部肌肉組織。
3造模細節(jié)與差異
盲腸處理
用鈍頭彎鑷輕輕帶出盲腸，注意不要損壞腸系膜，確保不要結(jié)扎回盲瓣，穿孔的時候小心避免刺破血管，保持腸道的活性及連續(xù)性。
結(jié)扎比例
手術(shù)關(guān)鍵:
結(jié)扎的（ 盲腸遠端到結(jié)扎之間的距離 ）：（ 結(jié)扎到回盲瓣的距離 ） 比例一致。
① 輕度敗血癥的比例 25% ：75%
② 中度敗血癥的比例 50% ：50%
③ 重度敗血癥的比例 75% ：25%
總結(jié)：越靠近遠端結(jié)扎 癥狀越輕
在CLP模型中，盲腸結(jié)扎長度明顯影響小鼠死亡率。但對于應(yīng)按比例結(jié)扎或是按固定長度結(jié)扎無一致標準，其相應(yīng)的死亡率也有較大差異 。
小鼠的盲腸長度變異較大，其范圍約在2.8~4.3cm之間，四分位數(shù)間距（ 0.4cm ）個體間存在一定差異，若全部按固定長度結(jié)扎（ 較多文獻選用1cm作為小鼠盲腸結(jié)扎的標準長度 ) ，可能會造成較大變異，影響實驗結(jié)果。故結(jié)扎前使用軟尺先測量整體盲腸長度（回盲部-盲腸末端） ，再按照比例結(jié)扎。
穿孔
穿孔數(shù)量：單孔、對穿孔（ 2孔 ）、多孔
針頭規(guī)格：0.7#（22G）、21G、1.2#（18G）
擠出的腸內(nèi)容物大小
糞便擠出后，將盲腸放回腹腔時注意不要將糞便蹭在外表皮膚上，若糞便沒有進入腹腔可能會導(dǎo)致造模失敗。
有研究表明，將造模后仍存活7d的小鼠解剖，解剖發(fā)現(xiàn)盲腸穿刺部位已經(jīng)被腹膜、腸管完全包裹，限制了膿毒癥反應(yīng)的進一步加重。
術(shù)后護理
關(guān)鍵步驟：
術(shù)后，皮下注射預(yù)熱生理鹽水（ 37℃；5ml/100g ）促使動物復(fù)蘇。
此外，預(yù)熱生理鹽水（ 37℃ ) 以避免體溫過低，這很可能會影響造模的結(jié)果。
術(shù)后護理要求:
蘇醒前，放置保溫墊上保持體溫
蘇醒后，將動物放回溫度控制（ 22℃ ）籠子里，自由進食、飲水，晝夜節(jié)律為12小時，飼養(yǎng)環(huán)境應(yīng)保持干凈，盡量無菌，防止造成二次感染。有條件可每6小時監(jiān)測動物生命體征一次，統(tǒng)計死亡率。
4后續(xù)檢測
評分觀察
觀察大鼠/小鼠的狀態(tài)：外觀，自主意識，自主活動，對刺激的反應(yīng)，眼睛是否有分泌物，呼吸頻率，呼吸質(zhì)量。
成模標準
膿毒癥成模標準:
動物出現(xiàn)發(fā)熱，心率、呼吸頻率明顯加快，口鼻腔分泌物增多，脫水、皮毛豎立，體重下降，稀便，精神萎靡，嗜睡，蜷縮，少動，少食或拒食，眼角出現(xiàn)分泌物等，此外，至少一個器官功能障礙為嚴重膿毒癥成模標準，常見能引起急性腎臟損傷。
動物于術(shù)后12h全身炎性反應(yīng)達峰值，12 小時后觀察小鼠活動次數(shù)明顯減少，出現(xiàn)呼吸急促、精神萎靡、白細胞計數(shù)及血 IL-6 水平升高。其中出現(xiàn)3項也可判斷為建模成功。
1.血清炎癥因子檢測：ELISA檢測模型大鼠/小鼠血清TNF-α（腫瘤壞死因子-α）、（白細胞介素）IL-1、IL-4、IL-6等
2.腎臟檢測（選用）：目前較為敏感的腎臟損傷標志物，如中性粒細胞酯酶、胱抑素C及最為常用的肌酐。該三項腎損傷指標均在 CLP 造模后2h開始升高。
3.透射電鏡：腎小管上皮細胞稍腫脹，細胞壞死、微血栓形成及炎癥細胞浸潤，有細胞空泡形成，空泡中含有被吞噬的線粒體結(jié)構(gòu)。