PCR (Polymerase Chain Reaction) 法是一種體外擴(kuò)增DNA的方法。因其操作簡(jiǎn)單，成本低，兼容性強(qiáng)等特點(diǎn)，已成為分子生物學(xué)的基礎(chǔ)工具，應(yīng)用已滲透至生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。

然而室溫下Taq DNA聚合酶具有殘留活性，會(huì)導(dǎo)致引物與模板非特異性結(jié)合，容易形成引物二聚體和錯(cuò)配的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)而影響到目標(biāo)核酸的擴(kuò)增效率。

Hot Start PCR法的出現(xiàn)動(dòng)機(jī)源于解決常規(guī)PCR在室溫配制反應(yīng)體系時(shí)發(fā)生的非特異性擴(kuò)增問(wèn)題，其核心原理是通過(guò)溫度依賴性抑制DNA聚合酶活性，確保擴(kuò)增反應(yīng)僅在高溫下啟動(dòng)。

通過(guò)物理、化學(xué)或生物手段在PCR循環(huán)前抑制DNA聚合酶活性，直至高溫激活階段釋放酶活，實(shí)現(xiàn)"低溫封鎖-高溫激活"的精準(zhǔn)控制，從而降低了非特異性擴(kuò)增，提高靶標(biāo)核酸的擴(kuò)增效率，降低假陽(yáng)性出現(xiàn)的概率。

圖示 不同的抑制酶活性的方案

早期的學(xué)者為了解決非特異擴(kuò)增的問(wèn)題，通過(guò)蠟層隔離酶和反應(yīng)液，然后通過(guò)高溫熔化使得試劑混合。存在耗時(shí)，操作復(fù)雜，容易污染等問(wèn)題。

利用酸酐等化學(xué)小分子修飾DNA聚合酶上的賴氨酸殘基，從而在常溫下抑制DNA聚合酶的活性。存在高溫激活時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題。

單封閉抗體或雙封閉抗體會(huì)通過(guò)結(jié)合酶活性中心形成空間位阻抑制活性?？贵w在PCR反應(yīng)初始熱激活步驟中變性并分離，從而使 Taq DNA 聚合酶發(fā)揮作用。由于抗體對(duì)熱極為敏感，因此抗體抑制酶的激活時(shí)間短，通常需要20s~5min即可完成。

核酸適配體可逆結(jié)合酶活性中心位置抑制其功能?？稍谙鄬?duì)較低的溫度進(jìn)行解離，釋放Taq酶活性。適配體修飾需依賴修飾核苷酸技術(shù)和高通量篩選平臺(tái)，面臨篩選成本高，穩(wěn)定性差等挑戰(zhàn)。

綜上所述，Hot Start PCR法的誕生動(dòng)機(jī)直指常規(guī)PCR的室溫活性殘留問(wèn)題，其本質(zhì)是通過(guò)溫度依賴性開(kāi)關(guān)機(jī)制重塑酶活性的時(shí)空控制?？傮w而言，熱啟動(dòng) DNA 聚合酶不僅廣泛應(yīng)用于傳染病領(lǐng)域，而且還廣泛應(yīng)用于其他行業(yè)，例如法醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)或基因測(cè)試。

隨著分子診斷的不斷發(fā)展，引物探針全預(yù)混試劑以方便快捷的優(yōu)勢(shì)成為熱門(mén)需求。然而傳統(tǒng)Taq酶抗體原料通常僅封閉Taq酶的聚合活性，其5'-3'外切酶活性仍然暴露，導(dǎo)致與探針混合后，在低溫下仍發(fā)生探針切割釋放信號(hào)，造成假陽(yáng)性的問(wèn)題。