基因組DNA經過二種酶不同的限制性內切酶酶切后，產生粘性末端，再使用連接酶將人工合成的雙鏈接頭連接在酶切位點的粘性末端。接頭一端具有與內切酶同樣的識別粘性末端，互補連接后成為DNA模板進行預擴增。接頭和與接頭相鄰的酶切片斷的幾個堿基序列作為引物的結合位點。引物由3部分組成: ①核心堿基序列，該堿基序列與人工接頭互補；②特異性酶切序列；③引物3’端選擇性堿基。選擇性堿基延伸到酶切片段區(qū)，這樣就只有那些兩端序列能與選擇堿基配對的限制性酶切片段被擴增。另外，通過選擇在末端分別添加了1～3個選擇性核苷酸的不同引物，可以達到選擇擴增的目的。這些選擇性核苷酸使得引物選擇性地識別具有特異配對序列的內切酶酶切片段。并與之結合，實現特異性擴增。
實驗材料
基因組DNA提取試劑盒；? EcoRI酶（或Pst I酶）,MseI酶，T4連接酶試劑盒； Taq酶，dNTP, PCR reaction buffer； AFLP引物；凝膠電泳所需試劑。
PCR儀，水平電泳和垂直電泳，銀染試劑，凝膠成像系統(tǒng)。
銀染試劑：
固定液：1%體積比的冰醋酸溶液。
染色液：1g AgNO3 ，1.5ml 37% 甲醛，加ddH2O定容至1L。
顯色液：30g Na2CO3，1.5ml 37% 甲醛，2mg硫代硫酸鈉，加ddH2O定容至1L。
實驗過程
一、基因組DNA提取
用基因組DNA提取試劑盒提取細胞基因組，通過凝膠電泳和分光光度計檢測DNA的濃度和純度。DNA可用純化試劑盒以提高純度，方便后續(xù)實驗進行。實驗所需的基因組DNA約100ng左右。
二、酶切處理
1、EcoRI酶切 20μL酶切體系
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成分 |
體積（ul） |
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載體DNA |
5 |
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10X Buffer |
2 |
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EcoRI |
1 |
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ddH2O |
補足12ul |
37℃酶切處理2h，65℃滅活處理30min，終止反應。
2、MseI酶切 20ul酶切體系
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成分 |
體積（ul） |
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載體DNA（EcoRI酶切產物） |
5 |
|
10X Buffer |
2 |
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MseI |
1 |
|
ddH2O |
補足12ul |
37℃酶切處理2h，80℃滅活處理30min，終止反應。
3、連接 20ul連接體系
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成分 |
體積（ul） |
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目的基因（雙酶切產物） |
10 |
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T4連接酶 |
2 |
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T4 Buffer |
2 |
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EcoRI接頭 |
1（10倍稀釋） |
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MseI 接頭 |
1（不稀釋） |
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ddH2O |
4 |
22℃連接2-3h。
4、預擴增 20ul反應體系
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成分 |
體積（ul） |
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連接產物 |
4 |
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引物（100uM分別稀釋14倍） |
1 |
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ddH2O |
8.8 |
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MgCl2 |
1.6 |
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dNTPs（2.5mM） |
1.6 |
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Tap 酶 |
1 |
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10 X Buffer |
2 |
預擴增程序
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Step 1 |
94℃ |
2min |
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Step 2 |
94℃ |
20s |
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Step 3 |
56℃ |
30s |
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Step 4 |
72℃ |
2min |
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Step 5 |
60℃ |
30min |
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Step 6 |
4℃ |
保持 |
Step 1預變性以后，step 2-step 4重復20個循環(huán)，然后進入step 5延伸。
5、選擇性擴增 20ul擴增體系
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成分 |
體積（ul） |
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預擴增產物（20倍稀釋） |
4 |
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引物（M引物100uM分別稀釋14倍，E引物100uM分別稀釋100倍） |
1 |
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ddH2O |
8.8 |
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MgCl2 |
1.6 |
|
dNTPs（2.5mM） |
1.6 |
|
Tap 酶 |
1 |
|
10 X Buffer |
2 |
擴增程序