Mucosal Immunol.｜呼吸道感染 “防線” 藏在哪？人腺樣體單細胞研究：拆解M細胞的免疫啟動機制

英文標題：Single cell transcriptional analysis of human adenoids identifies molecular features of airway microfold cells

中文標題：人腺樣體單細胞轉錄組分析揭示呼吸道微皺褶細胞的分析特征

發表期刊：Mucosal Immunology

影響因子：7.6

文章背景

呼吸道作為病原體（如結核分枝桿菌、SARS-CoV-2、流感病毒等）入侵人體的首要門戶，其黏膜免疫防御系統是抵御感染的關鍵屏障。人腺樣體作為上呼吸道黏膜相關淋巴組織(MALT)的核心組成部分，長期被認為在局部免疫應答中發揮重要作用，但由于傳統研究技術的局限，其內部細胞群體的具體分類、功能特征及互作機制尚未被完全解析——尤其是對黏膜免疫啟動至關重要的微皺褶細胞（M細胞），其在人腺樣體中的發育起源、分子標識及抗原轉運調控機制仍存在諸多未知。同時，此前研究也未明確人腺樣體中是否存在能快速感知病原體、啟動早期免疫反應的特殊細胞類型，這極大限制了對呼吸道感染防御機制的深入理解，也為相關黏膜疫苗研發和抗感染治療靶點篩選帶來阻礙。在此背景下，借助單細胞轉錄組測序(snRNA-seq)等高精度技術，系統解析人腺樣體的細胞組成與分子特征，挖掘關鍵免疫細胞（如M細胞）的功能機制，成為填補呼吸道黏膜免疫研究空白、推動抗感染領域發展的迫切需求。

技術路線

研究結果

1、人腺樣體的細胞組成與譜系界定

為解析上呼吸道黏膜相關淋巴組織的細胞組成，研究人員收集6名接受選擇性腺樣體切除術捐贈者的臨床腺樣體組織，通過單細胞核RNA測序(snRNA-seq)分析16,779個細胞核（圖1A）。經UMAP降維后，通過手動核對各細胞核群體的細胞類型基因表達標志物，鑒定出3種細胞核譜系（圖1B）：造血細胞譜系：因高表達蛋白酪氨酸磷酸酶受體C（PTPRC，即CD45）、分化簇38(CD38)和信號淋巴細胞激活分子家族成員1(SLAMF1)被明確界定，該譜系共包含11,514個細胞核；基底/丘狀譜系：該譜系表達胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP3)、角蛋白8(KRT8)、蛋白酶體26S亞基非ATP酶5(PSMD5)等基底祖細胞、丘狀細胞及神經內分泌細胞標記，共包含2,796個細胞核；杯狀細胞譜系：表達鈣黏蛋白相關家族成員3(CDHR3)、叉頭框J1(FOXJ1)、黏蛋白5B(MUC5B)等纖毛細胞、杯狀細胞及微皺褶細胞（M細胞）標記（如腫瘤壞死因子受體超家族成員11a，TNFRSF11A），共包含2,469個細胞核；且基底/丘狀譜系與杯狀細胞譜系均不表達免疫細胞相關標記及差異表達基因(DEGs)（圖1C）。與此同時，模塊分數分析表明：造血譜系細胞核表達B細胞標記CD19、T細胞受體ζ鏈CD247、樹突狀細胞標記ITGAX(CD11c)等免疫細胞標記；基底/丘狀譜系表達IGFBP3、XVII型膠原α1鏈(COL17A1)、KRT8等相關基因；杯狀細胞譜系表達分泌珠蛋白1A1(SCGB1A1)、CDHR3、MUC5AC/5B及 TNFRSF11A（圖1D-F）。

圖1. 人腺樣體的細胞組成

2、造血譜系細胞的表征

在確定造血譜系簇后，研究人員利用UMAP降維進行細胞亞群分析，共鑒定出15種免疫相關細胞類型（圖2A）。與此同時，比例分析顯示，造血譜系中B細胞、T細胞及巨噬細胞比例與先前研究一致，NK細胞略高，濾泡樹突狀細胞等因稀缺性與其他次級淋巴組織相符。值得注意的是，濾泡樹突狀細胞的轉錄特征含造血譜系標記（圖2B）。

圖2. 造血譜系細胞的特征

3、基底/丘狀譜系細胞群體的表征

研究人員對基底/丘狀譜系進行亞群分析，分別鑒定出基底細胞祖細胞、神經內分泌細胞、簇細胞、丘狀細胞及未知細胞類型(UCT)（圖3A）。5個細胞亞群差異表達基因(DEGs)顯示，UCT除基底細胞DEGs外，還高表達干擾素刺激基因(ISGs)，具有獨特轉錄特征（圖3B）。

擬時序分析顯示：基底來源細胞聚集，丘狀細胞獨立成簇，是兩條不同分化路徑（圖3C），且丘狀細胞起源顯著早于其他細胞簇，而基底相關簇呈現的中位擬時序值相近，反映其共同源自基底細胞（圖3D）。不同細胞亞群的代表性DEGs擬時序分析，再次印證了基底來源細胞與丘狀細胞不同起源；以及基底相關簇細胞的DEGs表達模式可能與丘狀細胞不同（圖3E）。這些結果闡述了人腺樣體中基底細胞、其后代及丘狀細胞的轉錄特征，并首次發現具有獨特轉錄特征的UCT。

圖3. 基底/丘狀譜系細胞群的特征

4、“未知細胞類型”(UCT)是具有獨特干擾素相關基因特征的基底細胞后代

研究人員對UCT進行探究，結果顯示，UCT的顯著DEGs的表達水平與其他基底/丘狀譜系細胞差異顯著，且在人腺樣體所有細胞核群體中獨特表達（圖 4A）；而新鑒定的UCT特異性DEGs與僅基于基底/丘狀譜系分析的結果高度重疊，顯著DEGs幾乎一致（圖4B）。進一步分析發現UCT的DEGs富集于三類生物學過程：細胞信號傳導、感染反應、遷移與分化。細胞間通訊進一步發現，UCT與神經內分泌細胞、γ-δ T細胞、T調節細胞等存在強相互作用，其中與神經內分泌細胞的相互作用最強（圖4C），主要通過PTPRM通路和THBS1-SDC4通路實現（圖4D）。

此外人腭扁桃體單細胞圖譜中標記為“VEGFA+細胞”的群體也表達UCT的DEGs（圖4E）。免疫熒光驗證顯示，IFIT3、IFIH1、DDX58在人腺樣體上皮細胞中共定位，且在4名獨立捐贈者中均存在（圖5A）。驗證細胞間互作發現，UCT與FYN陽性細胞接近，且與僅表達CFTR的基底衍生細胞相鄰（圖5B-D）。

綜上表明，UCT是基底細胞譜系中具有獨特干擾素相關基因特征的細胞類型，參與感染反應相關過程，并與其他細胞存在特異性相互作用。

圖4. “未知細胞類型”是基底細胞的后代，具有獨特的干擾素相關基因特征

圖5. “未知細胞類型”的top差異表達基因和細胞間相互作用的驗證

5、杯狀細胞譜系細胞群體的表征

研究人員對杯狀相關細胞譜系進行亞群再分析，并標記出獨特細胞核群體（圖6A）。與此同時，杯狀細胞譜系中的分泌型杯狀細胞分為兩型：杯狀細胞-1表達MUC5AC/5B，杯狀細胞-2表達MUC4、IL19等，兩者共享BPIFB1、PIGR等黏液相關DEGs但表達水平不同（圖6B）。而M細胞分為未成熟和成熟兩群，未成熟M細胞DEGs平均表達低于成熟型，與小鼠胃腸道M細胞分化中過渡群體的描述一致（圖6B）。

Monocle 3軌跡分析發現：杯狀細胞主要位于中心，纖毛細胞富集于左側，M細胞在右側，兩群杯狀細胞在中央重疊（圖6C）。擬時序分析顯示，杯狀細胞為最早出現的細胞，隨后是兩群杯狀細胞和未成熟M細胞，成熟M細胞和纖毛細胞中位偽時間值較大（圖6D）。 顯著DEGs表達模式顯示：杯狀細胞的SNX29在軌跡中央細胞中高表達；纖毛細胞的CDHR3在軌跡左側表達增加；杯狀細胞的MUC5B/MUC4在軌跡兩分支重疊表達；未成熟M細胞的SOX5在對應軌跡區域表達；成熟M細胞的CEMIP在軌跡右側末端高表達（圖6E）。研究者進一步提出了細胞分化模型：杯狀細胞祖細胞先分化為未成熟M細胞和杯狀細胞，未成熟M細胞進一步分化為成熟M細胞，纖毛細胞經較長時間直接源自杯狀細胞；杯狀細胞-1為向杯狀細胞-2過渡的中間群體（圖6F）。 這些結果闡述了杯狀相關譜系及其分化路徑。

圖6. 杯狀細胞群的特征

6、人腺樣體M細胞的表征

研究人員進一步參考人胃腸道、類器官及小鼠肺M細胞的潛在標記物，對M細胞進行分析（圖7A）。結果顯示，成熟M細胞高表達SPIB、TNFRSF11A及TNFAIP2，而GP2、CCL20及TNFRSF11B表達極低或未檢測到（圖7A）。

成熟M細胞的DEGs分析發現，杯狀細胞譜系分析與全細胞分析的DEGs大部分重疊，僅少數基因特有。全細胞分析的顯著DEGs包括CEMIP、MYBPC1等與黏膜免疫相關的基因（圖7B）。通路分析顯示，成熟M細胞富集細胞黏附、信號傳導及運輸相關通路，與M細胞的轉胞吞功能一致。細胞通訊分析表明，未成熟M細胞與暗區B細胞、記憶B細胞等相互作用最強；成熟M細胞則與基底細胞、UCT等作用顯著（圖7C）。未成熟M細胞主要通過PTPRC-CD22通路與免疫細胞作用，成熟M細胞主要依賴PTPRM-PTPRM通路（圖7D）。

免疫熒光實驗表明，CEMIP與M細胞標記NKM 16-2-4、TNFAIP2共定位（圖8A）。成熟M細胞與UCT及基底衍生細胞在接觸點附近有PTPRM表達（圖8B）；未成熟M細胞（CDH18陽性）與暗區增殖性B細胞（MAST2陽性）、FYN陽性細胞通過CD22在接觸部位相互作用（圖8C-E）。這些結果表征了人腺樣體中未成熟和成熟兩群M細胞的分子特征、功能通路及與其他細胞的相互作用。

圖7. 人腺樣體M細胞的特征

圖8. 腺樣體M細胞top差異表達基因及細胞間相互作用的驗證

7、人腺樣體M細胞差異表達基因的比較分析

研究人員將M細胞的DEGs與先前的氣道和胃腸道細胞圖譜研究進行比較。結果發現，未成熟M細胞的DEGs中，僅DOCK8、PLGC2、TNFAIP8在幾乎所有人扁桃體上皮細胞中顯著表達（圖9A）。與此同時，相比小鼠肺和氣管M細胞圖譜，人成熟M細胞的CEMIP、MYBPC1等DEGs幾乎低表達或不表達；而未成熟M細胞DEGs在小鼠圖譜中無一致模式（圖9B-C）。

進一步與經RANKL處理的小鼠腸道類器官M細胞比較顯示，該體外誘導的M細胞群體顯著表達上述4個成熟M細胞DEGs，且表達人腺樣體未成熟M細胞標記物DOCK8、PLGC2、TNFAIP8（圖9D）。這些結果表明，人腺樣體M細胞存在獨特表達的基因，凸顯空間定位對M細胞轉錄組的影響。

圖9. 人類腺樣體M細胞差異表達基因的比較分析

研究結論

本研究通過單細胞核RNA測序(snRNA-seq)，對6名健康供體的人腺樣體組織進行分析，構建出含26種獨特細胞類型的圖譜，涵蓋造血、基底/丘狀、杯狀細胞三大譜系。研究明確人氣道M細胞源于杯狀細胞祖細胞，分未成熟與成熟兩群，成熟M細胞高表達SPIB等基因且富集與轉胞吞功能相關的通路；還在基底/丘狀譜系發現高表達干擾素刺激基因的未知細胞類型UCT，并厘清杯狀細胞譜系分化路徑。結合軌跡分析、細胞通訊預測及免疫熒光驗證，研究為理解氣道黏膜免疫、病原體早期相互作用及黏膜疫苗研發提供重要依據。