頂刊聚焦：Orbitrap Astral憑什么成為代謝組學“新寵”？兩大核心技術破解鑒定難題
隨著代謝組學研究的深入，復雜生物樣本中低豐度代謝物與外源化合物的精準鑒定已成為推動疾病機制研究和生物標志物發現的關鍵。然而，傳統質譜技術在檢測靈敏度、掃描速度與數據解析能力方面仍存在局限，限制了其在全局代謝物覆蓋與高置信度注釋方面的應用。近年來，Orbitrap Astral質譜儀的推出，以其超高靈敏度、快速MS/MS采集速度和高分辨率性能，為代謝組學研究帶來了前所未有的技術突破。本文分享兩篇基于Astral的研究，分別從譜圖去噪與結構引導網絡注釋兩個維度，系統闡述Astral儀器在提升代謝物鑒定數量、質量與效率方面的顯著優勢。
文章一
英文標題：Denoising Search doubles the number of metabolite and exposome annotations in human plasma using an Orbitrap Astral mass spectrometer
發表期刊：nature methods
影響因子：32.1
研究背景
化學暴露可能影響人類代謝，并導致阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)等神經退行性疾病的發生。這些外源化合物和活性代謝物在體內通常濃度極低，并且噪聲離子的存在會顯著降低質譜質量，導致假陰性和識別率下降。為應對這一挑戰，Spectral Denoising算法應運而生。在對240種測試代謝物的基準研究中，質譜去噪表現優于其他方法。對于在Orbitrap Astral質譜儀上分析的AD患者血漿樣本，Denoising Search檢測到的注釋化合物數量是Exploris 240 Orbitrap儀器的2.3倍，包括藥物代謝物、家庭和工業化學品以及農藥。這種先進儀器與優越去噪算法的結合，為精準醫學在暴露組學研究中的應用開辟了新的道路。
研究結果
1、Spectral Denoising算法的高效性與可靠性
圖1展示了Spectral Denoising算法如何去除在碰撞誘導的MS/MS譜圖中記錄的、不代表前體離子真實碎片的離子。在電子去噪有效性驗證中，一個用于精準識別并移除“草狀”電子噪聲的閾值被確立，成功保留了低豐度的真實碎片離子，使得在不影響信息完整性的前提下顯著提升了信號信噪比（圖1a）。對于化學去噪的準確性，該算法通過計算碎片離子的精確質量與母離子間的“化學上合理丟失”來識別化學噪聲（圖1c）；同時，分子式信息可以從參考質譜庫（如NIST23、MassBank.us或GNPS）的匹配結果中檢索到，也可以使用化學信息學工具計算出來（圖1b）。當將電子與化學去噪步驟整合后，在1萬條NIST23譜圖上進行了大規模驗證。結果表明，去噪后的譜圖與原始高質量譜圖的MS/MS熵相似度平均值高達0.99以上。因此，Spectral Denoising在大規模數據處理中，既能高效去除噪聲，又幾乎不損失任何真實碎片信息，確保了譜圖匹配的高準確度。
圖1 Spectral Denoising流程圖
2、對在500-0.02 pmol進樣量范圍內的質譜圖進行去噪
為評估去噪算法區分噪聲離子和真實碎片離子的能力，“解釋離子強度”被用以量化每個譜圖中真實離子強度的比例（圖2a）。在質譜熵相似度的概率分布圖中（圖2b），隨著進樣量的降低，中位質譜匹配相似度也顯著下降。當進樣量為1 pmol時，超過65%的MS/MS譜圖在質譜熵相似度大于0.75的閾值下無法匹配參考譜圖（圖2b）。重要的是，Spectral Denoising算法對于所有測試化合物都有效地去除了化學和電子噪聲離子（圖2c），即使是在200 pmol進樣時，仍有25%的化合物顯示出0.05的質譜熵相似度增益（圖2c）。在相關示例譜圖，經過Spectral Denoising后的亞精胺譜圖實現了完美的匹配，質譜熵相似度達到0.95（圖2d）。
為評估Spectral Denoising的效率，三種主要的MS/MS去噪技術（1% bp thresholding法、DNL denoising法、MS Reduce法）被用于基準測試。相比之下，Spectral Denoising方法在質譜匹配上取得了實質性的增益，中位數質譜熵相似度、譜圖的匹配相似度、化合物注釋率均得到有效提升（圖2e）。
此外，與在未處理的原始MS/MS譜圖中達到>0.75相似度所需的最低進樣量比較，經過Spectral Denoising處理后所需的最低進樣量之間的倍數變化如圖2f所示。結果顯示，其他方法不僅效果微乎其微，甚至會因錯誤移除真實碎片離子而導致假陰性，損害數據質量；相比之下，Spectral Denoising方法將上樣所需的摩爾量降低了35倍，且沒有一種化合物在去噪后出現假陰性。
圖2 Spectral Denoising算法的開發、驗證與基準測試
3、Spectral Denoising技術在去除人工噪聲離子的應用
為驗證Spectral Denoising在復雜樣本中面對化學噪聲和電子噪聲時的穩定性，九種不同污染水平的人工嵌合譜圖被構建，并與現有的主流方法（1% bp thresholding法、DNL denoising法、MS Reduce法）進行了對比測試（圖3）。結果表明，在所有九種噪聲污染場景下，Spectral Denoising能將受污染譜圖的中位數熵相似度從添加噪聲后的約0.5，有效恢復至接近原始譜圖的0.8水平，顯著優于其他方法。相比之下，MS Reduce、DNL denoising和1% bp thresholding方法不僅效果有限，甚至在某些情況下會損害譜圖匹配質量。此外，Spectral Denoising在應對不同組合的化學和電子噪聲時表現出極高的穩定性，無論噪聲是來自高豐度的化學干擾物，還是低強度但廣泛的電子“草狀噪聲”，該算法都能有效識別并去除，從而恢復譜圖的核心特征。有趣的是，對于碎片離子少、熵值低的譜圖，Spectral Denoising的提升效果最為顯著，匹配質量更穩定（圖4）。綜上，Spectral Denoising較其他技術的表現更佳，并且在不同水平的化學和電子噪聲污染下都極其穩健；當處理代謝組學中常見的稀疏碎片譜圖時，其底層假設更準確，因此性能更優越，是更為可靠的選擇。
圖 3 在不同水平的人為添加的化學和電子噪聲下，應用三種質譜去噪算法基準方法前后的MS/MS熵相似度的概率分布
圖 4 以500 pmoL譜圖為參照物，對240個進樣標準譜在0.02-200 pmoL范圍內的所有MS/MS譜圖進行去噪處理后，改進MS/MS相似度的密度分布
4、去噪搜索技術在阿爾茨海默病血漿樣本的質譜/質譜數據分析中的應用
與Exploris的原始MS/MS譜圖相比，Denoising Search在Astral數據上導致了2.5倍的注釋增加，其中包括許多在Exploris Orbitrap儀器上未發現的暴露組化合物（圖5a）。另外，在一臺個人筆記本電腦上，Denoising Search搜索包含200萬譜圖的復合參考庫，平均處理時間僅為100毫秒/譜圖。值得注意的是，對于原始熵相似度≥0.4的Astral譜圖，使用Denoising Search后，其MS/MS熵相似度的中位數提升了0.1（圖5b）。當對七個主要ClassyFire化合物超類的進一步分析時，相較Exploris儀器，Denoising Search在Astral譜圖上注釋的化合物數量在所有超類中均顯著增加（圖5c）。
基于Astral Orbitrap質譜儀的高靈敏度和前所未有的采集速度，讓其與Denoising Search的強去噪能力結合，成功鑒定出人類血液中未被充分研究的幾種化合物（圖5d）。此外，通過準確質量與MS/MS匹配，還首次鑒定出了受阻酚抗氧化劑Irganox 565（圖5d）。這一發現不僅填補了該物質在人體暴露研究中的空白，也證明了該方法在發現新生物標志物和環境污染物方面的強大潛力。
圖 5 在Exploris 240 Orbitrap儀器和Astral質譜儀上，對20名阿爾茨海默病患者血漿樣本進行正離子ESI模式疏水作用LC-MS/MS分析的Denoising Search結果
研究小結
本研究核心在于開發并驗證了Denoising Search算法，其涉及Spectral Denoising算法與譜圖搜索流程的整合，是一種針對代謝組學和暴露組學中低豐度化合物譜圖去噪的有效策略。其中，Spectral Denoising算法通過結合強度建模和子公式分配，能夠有效去除噪聲離子，同時保留真實的碎片離子，顯著提升了MS/MS熵相似度。此外，Spectral Denoising在與多種替代去噪算法的基準測試中持續表現出色，不僅提升了熵相似度，還提高了高置信度注釋的絕對數量限值，其性能在不同噪聲水平下保持穩定。當Denoising Search應用于最新的Astral質譜儀時，相比經典Exploris 240質譜儀的常規方法，其能夠注釋的化合物數量提升了2.5倍，且效果覆蓋所有主要化學超類。未來該方案可結合保留時間匹配、分子橫截面比較等正交實驗手段，以進一步提高化合物注釋的置信。總而言之，Denoising Search是一種強大的工具，有望顯著提升代謝組學和暴露組學研究的覆蓋廣度和深度。
盡管Denoising Search通過提升譜圖質量顯著增強了代謝物鑒定的準確性，但在復雜生物樣本中，如何系統性地構建代謝物網絡并實現高覆蓋注釋仍是另一大挑戰。Astral儀器不僅為去噪算法提供了高質量原始數據，其高速度、高靈敏的MS/MS采集能力也為結構引導的網絡注釋方法帶來了新的可能。下文將介紹一項基于Astral平臺的增強型結構引導分子網絡(E-SGMN)研究，進一步展示Astral在提升注釋規模與準確性方面的綜合優勢。
文章二
英文標題：Enhanced Structure-guided Molecular Networking Annotation Method for Untargeted Metabolomics Data from Orbitrap Astral Mass Spectrometer
發表期刊：analyical chemistry
影響因子：6.7
研究背景
復雜樣品中化合物的快速、高效和準確注釋仍是代謝組學中的一個重大挑戰。最近開發的Orbitrap Astral質譜儀將傳統的四極桿Orbitrap與新型Astral質量分析器相結合，提供了快速的MS/MS掃描速度和高靈敏度。然而，現有的代謝組學注釋方法尚未充分利用 Astral MS的先進能力。本研究提出了一種增強型結構引導分子網絡(Enhanced Structure-Guided Molecular Networking, E-SGMN)方法。E-SGMN通過準確地提高網絡規模來擴大標注覆蓋范圍，同時最大限度地減少不相關化合物的包含，實現標注規模和準確性之間的平衡。該方法不僅增強了注釋覆蓋率，而且為理解復雜的生物系統提供了一種變革性的工具，在生命科學和臨床醫學方面具有巨大的潛力。
研究結果
1、方法工作流程
所提出的策略包括三個步驟（圖1）。首先，使用Orbitrap Astral質譜儀獲取大量非靶標LC-MS/MS代謝組學數據。其次，開發了增強的結構引導分子網絡(E-SGMN)來改進代謝物注釋。最后，E-SGMN用于代謝物注釋。在徹底評估tR和精確質量容差對注釋性能的影響后，確定了tR為30%和精確質量為10 ppm的最佳容差。與基于SGMN的注釋類似，E-SGMN利用基于網絡的傳播，通過整合tR、MS1和譜圖相似性來實現全面和準確的代謝物注釋。這種基于E-SGMN的注釋方法擴展了代謝物覆蓋范圍，同時最大限度地減少了冗余分子條目，確保了注釋覆蓋范圍和準確性之間的平衡。
圖1. 使用Orbitrap Astral MS和增強的結構引導分子網絡(E-SGMN)進行全球代謝組注釋的工作流程
2、高效準確地構建E-SGMN
本研究構建了五個不同組成和大小的分子網絡（四個SGMN和一個E-SGMN），每個網絡都包含所有850種標準代謝物。如圖2a所示，MN1-1(SGMN)代表一個血液特異性網絡，包含來自內部數據庫OSI/SMMS的432種和來自HMDB的4466種血液中檢測到的內源性代謝物。MN2(SGMN)是一個代謝物驅動的網絡，由來自KEGG的7236種代謝物與OSI/SMMS整合而成。MN3-1(SGMN)是一個血液-代謝物混合網絡，由MN1-1和MN2合并而成，包含10,305種代謝物。MN4(SGMN)是一個泛生物樣本網絡，包含17,633種代謝物，通過進一步整合HMDB的所有檢測到的內源性代謝物而構建。MN5(E-SGMN)是通過在MN4的基礎上增加來自HMDB的3948種預期/預測內源性代謝物而構建的，這些代謝物通過來自五個典型生物樣品的Orbitrap Astral LC-MS數據進行過濾，從而形成了一個包含21,581種代謝物的綜合數據集（表1）。這些網絡表現出良好的連接性、強魯棒性和高重復性，并且對于非靶代謝組學數據中可靠的網絡傳播注釋至關重要。
表1. 九種分子網絡的詳細信息
本研究基于五個MNs，分析了模擬加標血漿樣品數據集，并評估了注釋規模、覆蓋率和準確性。如圖2b所示，隨著網絡大小從4,898增加到21,581，注釋的加標標準品數量從568緩慢增加到704。注釋覆蓋率從66.82%增加到82.82%，而注釋準確率從90.14%下降到80.54%。值得注意的是，準確注釋的數量沒有繼續增長。表明在理想條件下，較大的MNs并不能有效提高加標標準品的注釋性能。基于不同的MNs，血漿中注釋的代謝物數量從718增加到2299。由于血漿中的注釋特征也同步增加，這表明將網絡大小從MN1-1擴展到MN5對于注釋真實生物樣品是有效的。值得注意的是，血液特異性網絡(MN1-1)和血液-代謝物混合網絡(MN3-1)產生的注釋明顯少于MN4和MN5，進一步證明了知識數據庫中的可靠證據代謝物忽略了使用最先進技術Orbitrap Astral容易檢測到的代謝物。
圖2. 背景網絡的來源和大小對RPLC-ESI+-Astral中模擬尖峰NIST SRM 1950人血漿注釋性能的影響
3、方法驗證
在加標的標準代謝物中，在Orbitrap Astral和QE HF中檢測到95個加標標準品的MS/MS譜，以直接比較注釋性能。SGMN-QE HF和E-SGMN-Astral分別注釋了69.47%和76.84%的加標標準品（圖3a）。此外，SGMN-QE HF和E-SGMN-Astral分別正確鑒定了71.21%和78.08%的注釋標準品（圖3a）。其中，與SGMN-QE HF相比，E-SGMN-Astral注釋了10種額外的代謝物，無假陽性。相比之下，與E-SGMN-Astral相比，SGMN-QE HF僅注釋了3種額外的代謝物，但所有注釋都不正確。這些結果表明E-SGMN-Astral在保持高準確性的同時提高了注釋性能。
4、與其他注釋方法的比較
第一種注釋方法涉及將MS1、MS/MS和保留時間(tR)與1384種市售標準代謝物進行匹配，第二種方法使用MS1和MS/MS與參考光譜數據庫進行匹配。E-SGRN-Astral注釋的2279、3537、2215、1267、3932和4863代謝物特征，分別來自NIST SRM 1950人血漿、NIST SRM 3667人尿液、組織、細胞、糞便和合并樣本（圖3b）。相反，通過將MS1、MS/MS和tR與NIST SRM 1950 人血漿、NIST SRM 3667 人尿、組織、細胞、糞便和混合樣品的標準品進行匹配，僅鑒定出100、101、122、72、99和110種代謝物。這些結果表明E-SGMN-Astral相對于傳統方法的優越注釋能力。因此，E-SGMN對于高性能Orbitrap Astral數據集中的大規模代謝物注釋更為有效。
在RPLC-ESI+-HRMS/MS中，比較了E-SGMN-Astral和SGMN-QE HF對六種生物樣品的注釋性能（圖3c）。結果表明，E-SGMN-Astral注釋的代謝物特征數量是SGMN-QE HF的2.9-4.3倍。
為了評估Orbitrap Astral的貢獻，比較了SGMN-QE HF和SGMN-Astral的注釋結果。結果發現，QE HF和Astral分別檢測到6047和17,504個代謝物特征。其中，4231（69.97%）和 14,830（84.72%）個特征具有相應的MS/MS譜（圖3d）。此外，SGMN-QE HF和SGMN-Astral分別注釋了705和1870個代謝物。這代表僅由Orbitrap Astral實現的注釋覆蓋率增加了165%，主要歸因于其更快的 MS/MS 掃描速度和更高的檢測靈敏度。
通過比較SGMN-Astral和E-SGMN-Astral來評估E-SGMN的影響。加入3948個額外的高置信度候選物后，E-SGMN網絡大小比原始SGMN增加了22.4%。SGMN-Astral和E-SGMN-Astral分別注釋了1870和2279個代謝物（圖3d）。這表明，與基礎SGMN相比，僅E-SGMN就將注釋覆蓋率提高了21.9%。注釋代謝物的增加比例相對于映射特征的增加比例更大，這證明了E-SGMN在擴展代謝物覆蓋范圍方面的有效性。
圖3. RPLC-ESI+-HRMS/MS中注釋性能的驗證
最后，為了評估Orbitrap Astral和E-SGMN的綜合影響，比較了QE HF-SGMN和Orbitrap Astral-E-SGMN的注釋性能。如圖3d所示，Orbitrap Astral和E-SGMN的組合導致網絡映射特征增加了215%，注釋覆蓋率增加了223%。這種非累加增益突出了先進質譜儀器和數據驅動注釋策略的互補優勢。具體而言，Orbitrap Astral由于其改進的檢測能力而提供了更豐富的光譜數據，E-SGMN利用這些數據來最大化注釋性能。
進一步比較了E-SGMN-Astral和SGMN-QE HF之間的重疊和唯一注釋。E-SGMN-Astral和SGMN-QE HF分別注釋了5440和1507個代謝物特征。兩種方法都檢測和注釋了1226個代謝物特征的共同集合（圖4a）。E-SGMN-Astral唯一注釋了4214個代謝物特征，包括低豐度代謝物，其平均峰值強度較低（圖4b）。這些發現表明，E-SGMN-Astral有效地捕獲了傳統工作流程中經常忽略的低豐度代謝物特征。通過將Orbitrap Astral的卓越檢測能力與E-SGMN增強的注釋策略相結合，實現了全面和高度特異性的代謝物鑒定。
圖4. E-SGMN-Astral和SGMN-QE HF之間的重疊和唯一注釋比較
研究小結
在這項研究中，E-SGMN策略是專門為Astral質譜儀開發的。與現有的分子網絡注釋方法不同，E-SGMN整合了先前測量的代謝物和由Astral MS數據過濾的潛在代謝物。這種構建策略允許在背景網絡中包含更有效的候選物，同時最大限度地減少不相關分子的引入，從而在網絡內實現標注覆蓋率和準確性之間的最佳平衡。對六種不同生物基質的比較分析表明，Astral與E-SGMN集成的性能優于QE HF儀器，注釋代謝物特征的數量顯著增加。從NIST SRM 1950人血漿中，注釋了5440個特征，是QE HF的3.6倍。與其他注釋方法相比，E-SGMN的注釋數量增加了3.7-44.2倍，突出了這種組合方法在更廣泛的代謝物覆蓋方面的潛力。E-SGMN更高的注釋覆蓋率和更精確地檢測和注釋代謝物的能力為研究人員提供了一個變革性的工具，允許更全面地了解復雜的生物系統。Astral與E-SGMN的整合代表了在追求更準確和高效的代謝組學分析方面向前邁出的重要一步，對生物醫學研究和生命科學具有深遠的意義。
綜上所述，Orbitrap Astral質譜儀憑借其超高靈敏度、快速MS/MS采集能力與高質量數據輸出，為代謝組學研究提供了堅實的技術基礎。無論是通過Denoising Search提升譜圖質量，還是借助E-SGMN擴展注釋網絡，Astral平臺均展現出在提升化合物鑒定數量、覆蓋廣度與注釋可信度方面的顯著優勢。兩項研究共同證明，Astral不僅推動了儀器性能的邊界，更通過與先進算法的深度融合，開啟了代謝組學研究的新紀元。未來，隨著更多定制化分析流程的開發與多組學整合策略的推進，Astral有望在疾病機制解析、生物標志物發現及精準醫學應用中發揮更加關鍵的作用。