PNAS (IF=9.1)｜天津醫科大學張鍇團隊鎖定組蛋白乳酸化“閱讀器”，揭開宮頸癌進展新機制！
文章標題：DPF2 reads histone lactylation to drive transcription and tumorigenesis
中文標題：DPF2通過識別組蛋白乳酸化驅動轉錄與腫瘤發生
發表期刊：PNAS
影響因子：9.1
文章簡介
天津醫科大學張鍇教授課題組在PNAS期刊發表了題為“DPF2 reads histone lactylation to drive transcription and tumorigenesis”的研究。這項研究鑒定出DPF2是組蛋白乳酸化修飾的特異性“閱讀器”，闡明其通過識別H3K14la調控癌基因轉錄、推動宮頸癌進展的分子機制，為代謝-表觀遺傳交叉領域及宮頸癌治療提供全新靶點！
研究背景
組蛋白翻譯后修飾(hPTMs)是表觀遺傳調控的核心環節，而近年發現的組蛋白乳酸化(Kla) ，更是打通了“細胞代謝”與“基因表達”的關鍵通路——癌細胞因瓦伯格效應產生的大量乳酸，可轉化為組蛋白乳酸化的“原料”，進而影響腫瘤進展。但長期以來，組蛋白乳酸化的特異性“閱讀器”始終未被發現，成為制約乳酸化調控機制研究的“瓶頸”。張鍇團隊此前開發的“自組裝多價光親和探針”技術，為捕獲這類瞬時結合的“閱讀器”提供了突破口——該研究正是基于該技術，針對宮頸癌中關鍵的H3K14la修飾展開探索。
研究結果
3.1 組蛋白乳酸化與細胞增殖及腫瘤發生相關
癌細胞即使在有氧條件下也常保持活躍糖酵解，經乳酸脫氫酶(LDH)催化生成大量乳酸，而乳酸可促進組蛋白乳酸化，但該修飾在宮頸癌中的作用尚不明確，故推測高LDH可能通過增加乳酸、升高組蛋白乳酸化介導宮頸癌發生。為驗證此推測，基因分析發現LDH在宮頸癌（含宮頸鱗癌/腺癌）及其他子宮癌中顯著上調，糖酵解關鍵酶PKM也高表達，且高LDH與患者短生存期相關，LDH抑制劑則能抑制癌細胞增殖，表明乳酸升高或與宮頸癌發生相關（圖1A-C）。進一步蛋白印跡分析顯示乳酸存在時組蛋白泛乳酸化顯著升高，從HeLa細胞中還鑒定出組蛋白乳酸化供體“乳酸輔酶A”，且LC-MS/MS檢測到HeLa細胞中H3K14la存在、乳酸預處理可提升其比例（圖1D-E）。綜上，乳酸是組蛋白乳酸化的直接決定因素，H3K14la等組蛋白乳酸化升高或參與宮頸癌發生進展。
圖1. 組蛋白乳酸化與細胞增殖及腫瘤發生相關
3.2 化學蛋白質組學方法鑒定DPF2為H3K14la的靶蛋白
組蛋白翻譯后修飾(hPTMs)可通過招募結合蛋白傳遞信號，據此推測H3K14la可能通過結合蛋白調控基因轉錄與腫瘤發生，且多價光親和探針結合定量蛋白質組學的策略，有助于解析其靶蛋白。該研究參照前期方法，構建了含多價乳酸化肽段、經光交聯劑連接PEG的H3K14la探針，還制備了僅將Kla替換為未修飾K的H3K14對照探針（圖2A）。隨后用兩種探針分別與核提取物孵育，經紫外線光交聯、清洗去除非特異性結合蛋白、分離標記蛋白后，通過磁珠酶解及定量LC-MS/MS篩選出170個相對于對照顯著富集的H3K14la候選結合蛋白（圖2B）；GO分析顯示這些蛋白多參與RNA結合、轉錄調控等功能（圖2C），且鑒定出組蛋白乳酸化修飾酶KAT5與去修飾酶HDAC3，其中與癌癥相關、可識別組蛋白乙?；?巴豆?；腂AF復合物亞基DPF2被確定為潛在結合蛋白，推測其可能通過識別H3K14la介導癌癥中的轉錄與表觀遺傳調控。
圖2. 使用多價光親和探針鑒定DPF2為H3K14la靶蛋白
3.3 DPF2在體外通過其DPF結構域結合H3K14la
已知DPF2的DPF結構域可結合組蛋白乙?；?，研究遂探究其是否直接結合H3K14la。重組表達DPF2的DPF結構域(DPF2DPF)后，ITC實驗顯示，其與H3K14la肽段的結合解離常數(Kd)為0.60 μM，與H3K14ac（H3K14乙?；╇亩蔚腒d為0.65 μM，而與未修飾H3K14肽段的Kd>100 μM（圖3A）；進一步檢測DPF1、DPF3的DPF結構域，發現二者與H3K14la的結合親和力幾乎完全喪失（圖3B），表明DPF2可通過DPF結構域在體外直接且高效結合H3K14la。
為解析相互作用機制，將DPF2DPF(PDB:5B79)與H3K14la肽段進行分子對接分析，發現DPF2DPF以類似識別Kac的模式識別Kla，H3的N端α-螺旋通過靜電作用和氫鍵與PHD2結合，Kla錨定于PHD1的疏水口袋，且Kla的乳酸酰胺基團嵌入D274、F275等殘基構成的“籠狀結構”，其羥基通過兩個直接氫鍵與D274相互作用（圖3C-E）；后續定點突變實驗（將D274、R300、D346突變為丙氨酸）顯示，所有突變體與H3K14la的結合親和力均較野生型顯著下降，證實DPF2通過DPF結構域，借助D274等關鍵殘基識別H3K14la。
圖3. DPF2在體外通過其DPF結構域結合H3K14la
3.4 DPF2在細胞內與H3K14la存在關聯
為驗證細胞內DPF2與H3K14la的關聯，該研究在HeLa細胞中分別過表達Flag 標簽標記的野生型DPF2(WT-DPF2)及兩種突變體(DPF2-D274A、DPF2-D274A-R300A），并通過基于Flag-DPF2的下拉實驗探究二者相互作用（圖4A）。實驗提取細胞染色質后，用抗Flag抗體磁珠進行免疫沉淀(IP)，后續蛋白質印跡分析顯示：野生型DPF2能捕獲乳酸化修飾的組蛋白H3，而突變體無法捕獲，證實細胞內DPF2與H3K14la存在關聯（圖4B）。
進一步通過免疫熒光(IF)實驗評估共定位情況：將轉染WT-DPF2或突變體的細胞與抗Flag（檢測DPF2）、抗H3K14la（檢測乳酸化組蛋白）抗體孵育，結果顯示WT-DPF2與H3K14la的信號重疊度高，皮爾遜相關系數達0.77，證實二者共定位；而DPF2突變體與H3K14la的皮爾遜相關系數顯著降低，表明突變破壞了二者共定位關系（圖4C-D）。綜上，這些結果提示細胞內DPF2與H3K14la存在關聯。
圖4. DPF2在細胞內與H3K14la存在關聯
3.5 DPF2與H3K14la在全基因組范圍內共定位并介導基因轉錄
為驗證DPF2在天然染色質上與H3K14la的結合，研究在乳酸預處理的HeLa細胞中開展CUT&Tag實驗：對穩定表達Flag-DPF2的細胞用抗Flag或抗H3K14la抗體免疫沉淀后高通量測序，鑒定出1803個H3K14la富集峰和9747個DPF2結合峰，其中1037個基因為二者共占（圖5A-C）；GO分析顯示這些重疊基因參與細胞增殖、遷移，與H3K14ac-DPF2共定位基因功能差異顯著，提示H3K14la沉積基因具特異性（圖5D），且Flag-BAF47的CUT&Tag實驗證實DPF2識別H3K14la依賴BAF復合物（圖5E）。
后續探究DPF結構域作用：穩定表達突變型DPF2(Mut-DPF2)的細胞CUT&Tag結果顯示，其啟動子區域結合豐度較野生型(WT-DPF2)顯著降低，靶基因（如SEMA5A）信號減弱（圖5F），表明DPF結構域對DPF2結合染色質至關重要；對乳酸預處理后表達WT/Mut-DPF2的細胞做RNA-Seq，發現DPF2突變導致600余個基因下調（多與細胞存活相關，癌基因表達受抑），且乳酸（而非乙酸）預處理僅升高H3K14la并促進轉錄，證實H3K14la介導基因激活（圖5G）。綜上，DPF2可能通過DPF結構域識別啟動子區H3K14la，進而介導基因轉錄。
圖5. DPF2與H3K14la在全基因組范圍內共定位，并介導基因轉錄
3.6 DPF2將組蛋白乳酸化與細胞存活關聯起來
基于此前發現“DPF2通過與H3K14la相互作用調控癌相關基因轉錄”，該研究進一步探究該關聯對癌細胞生長存活的影響：在乳酸喂養條件下進行CCK-8和集落形成實驗。結果顯示，即使有乳酸存在，敲低DPF2仍會顯著降低細胞增殖與集落形成能力，提示H3K14la的功能可能主要依賴與DPF2的結合；而異位表達野生型DPF2(WT-DPF2)可恢復上述能力，其突變體(Mut-DPF2)則無法恢復（圖6A-D）。
綜上，H3K14la通過結合DPF2促進癌相關基因表達，進而推動癌細胞生長存活。研究提出調控模型：DPF2識別組蛋白乳酸化并結合于靶基因啟動子，招募轉錄機器驅動癌基因表達與腫瘤細胞增殖；而通過DPF結構域突變破壞二者相互作用，或限制LDH活性降低組蛋白乳酸化水平，均可削弱細胞存活能力（圖 6E）。
圖6. DPF2將組蛋白乳酸化與細胞存活關聯起來
研究小結
這項研究不僅首次鑒定出組蛋白乳酸化的特異性“閱讀器”DPF2，更構建了“乳酸代謝→H3K14la修飾→DPF2結合→癌基因激活→宮頸癌進展”的完整調控鏈，為理解代謝異常如何通過表觀遺傳驅動腫瘤提供了全新范式。
在治療層面，靶向DPF2的D274殘基（破壞其與H3K14la結合），或抑制LDH降低H3K14la水平，有望成為宮頸癌精準治療的新策略——為后續藥物研發提供了明確靶點！
全景修飾蛋白質組學：作為一種蛋白質翻譯后修飾(PTM)研究技術，僅需一份生物樣本，即可實現對樣本中的多種蛋白質修飾類型進行鑒定與定量分析，能夠一次性精準鑒定數千種蛋白質上的上萬個修飾位點，有效規避了傳統方法因單次僅關注一種修飾類型而導致的大量關鍵修飾信息遺漏問題。百趣生物推出的全景修飾蛋白質組學技術，目前已實現對多種重要蛋白質翻譯后修飾類型的覆蓋，包括磷酸化、乙?；?、乳酸化、泛素化、琥珀?；取纳飳W功能層面來看，這些翻譯后修飾可通過改變蛋白質的理化性質、空間構象及活性狀態，在細胞信號傳導通路調控、物質代謝網絡平衡、疾病發生發展的分子機制等核心生理病理過程中發揮不可替代的關鍵調控作用。
百趣生物提供“全景修飾蛋白質組學”等專業技術服務，助您快速解鎖研究瓶頸。
END
hao 撰文
SY 校稿
