RNA質(zhì)量對PCR（尤其是RT-qPCR）實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性具有至關(guān)重要的影響，在進(jìn)行RT-qPCR或RNA測序等實(shí)驗(yàn)之前，必須對RNA的完整性、純度和濃度進(jìn)行全面評估。
RNA濃度評估
核酸分子所含的嘌呤和嘧啶堿基具有共軛雙鍵，在260nm波長處有最大吸收峰，因此，核酸的最大吸收波長為260nm，但它無法區(qū)分出DNA、RNA、降解核酸、游離核苷酸等雜質(zhì)；蛋白質(zhì)分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯環(huán)結(jié)構(gòu)，通常在280nm處有最大吸收峰；而碳水化合物，多肽，苯酚、EDTA等污染物的最大吸收峰則在230nm處，如圖1。
圖1. 核酸、蛋白質(zhì)、污染物的最大吸收峰（圖源網(wǎng)絡(luò)）
對于RNA的濃度來說，根據(jù)朗伯-比爾定律可計(jì)算出在波長260nm的紫外線下，1個(gè)OD值的光密度大約相當(dāng)于40µg/ml的RNA[1]，即RNA的濃度（µg/µl）= OD260×40×稀釋倍數(shù)/1000。比如OD260為0.16，2µl樣本稀釋至200µl，即稀釋倍數(shù)為100，RNA的濃度（µg/µl）= 0.16×40×100/1000µg/µl=0.64µg/µl。
RNA純度評估
一般來說，OD260/280=1.8-2.1，證明純度較好，值得一提的是，OD260/280的比值會受到pH的影響，當(dāng)用中性的水溶解RNA時(shí)候，RNA呈酸性，比值可能只有1.8-2.0之間；當(dāng)用TE溶解RNA時(shí)，比值會稍偏高，可能在1.9-2.1之間。
1）OD260/280<1.8，可能有蛋白質(zhì)或基因組的殘留；
2）OD260/OD280 > 2.1，表明RNA有部分降解，如果直接將其反轉(zhuǎn)得到的cDNA用于qPCR實(shí)驗(yàn)，可能會導(dǎo)致ct值偏大甚至沒有ct值；
3）OD260/OD230 < 2.0，可能有鹽離子、有機(jī)溶劑、碳水化合物等的污染，比如用trizol提取法中殘留的的異硫氰酸胍會導(dǎo)致230nm處的吸光值升高，從而導(dǎo)致比值偏低。
純度也可以通過瓊脂糖瓊膠電泳進(jìn)行評估，如下圖：
圖2. RNA中有DNA（左）或蛋白質(zhì)（右）的殘留
由圖2可看出，若泳道上部有明顯的高分子量雜帶，則可能是有DNA的殘留，不建議用于后續(xù)的qPCR實(shí)驗(yàn)，會對實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性造成影響（圖2左）；若在膠孔處有比較亮的著色成分，則是有蛋白質(zhì)的殘留（圖2右）。
RNA完整性評估
除了濃度、純度外，RNA完整性也是判斷RNA質(zhì)量的重要指標(biāo)。RNA完整性一般可通過瓊脂糖凝膠電泳來進(jìn)行評估?？俁NA中占比達(dá)80%以上的是核糖體RNA（rRNA），因此，膠圖呈現(xiàn)的結(jié)果主要是rRNA。
圖3. 高質(zhì)量RNA（左）和已降解RNA（右）的瓊脂糖凝膠電泳膠圖
對于真核生物來說，高質(zhì)量的RNA通常有三條帶，最亮的是28S，其次是18S，最淡的是5S。28S條帶亮度應(yīng)為18S條帶亮度的2倍(圖3左)，若RNA呈現(xiàn)彌散狀，表明RNA已降解（圖3右）。
附：RNA電泳注意事項(xiàng)：
1）電泳槽和膠板經(jīng)0.5 M NaOH浸泡0.5 h去除RNase；
2）緩沖液和瓊脂糖凝膠都需新配制，采用RNase-free H2O配制電泳緩沖液；
3）關(guān)于marker的選擇，建議使用RNA marker；
4）RNA電泳宜使用高電壓短時(shí)間的方法，以防電泳過程中RNA的降解。
相關(guān)產(chǎn)品
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應(yīng)用類型 |
產(chǎn)品名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
目錄價(jià) |
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凝膠電泳必備款 |
N132101S |
100 g |
180.00 |
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N132101M |
500 g |
810.00 |
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無需稱量，一次一片，不用擔(dān)心瓊脂糖掛壁 |
N132103S |
1 BOX (200 TABLETS) |
1200.00 |
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替代EB的無毒染料，適用藍(lán)光及紫外光 |
N132109S |
500 μL |
580.00 |