基于活性的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)（Activity-Based Protein Profiling，ABPP）是在活性化合物探針與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的小分子釣靶技術(shù)。隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，高通量質(zhì)譜和點擊化學(xué)（Click Chemistry）的融合極大提高了分析的靈敏度、分辨率以及化合物探針的生物相容性。基于炔基或光交聯(lián)基團(tuán)標(biāo)記的ABPP技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于化合物結(jié)合靶蛋白的篩選與鑒定，為闡明活性化合物的作用機制提供了關(guān)鍵助力。
圖1 ABPP技術(shù)實驗流程圖
半胱氨酸作為蛋白質(zhì)組中功能極為重要的氨基酸，具有高反應(yīng)性和多功能特性，能夠參與如酶的催化和變構(gòu)調(diào)控等多種生物學(xué)過程。由于其高反應(yīng)性，半胱氨酸已成為共價藥物設(shè)計的理想結(jié)合位點。由此，鑒定小分子化合物在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合靶蛋白的半胱氨酸位點，在藥物靶點發(fā)現(xiàn)、先導(dǎo)化合物優(yōu)化和基礎(chǔ)生物學(xué)機制研究中具有重要作用。近年來，針對蛋白質(zhì)半胱氨酸鑒定的ABPP技術(shù)層出不窮。
isoTOP-ABPP技術(shù)
2010年，來自斯克利普斯研究所的Benjamin F. Cravatt研究團(tuán)隊于《Nature》發(fā)表了一項題為“Quantitative reactivity profiling predicts functional cysteines in proteomes”的研究。該研究在ABPP技術(shù)的基礎(chǔ)上開發(fā)了一種競爭性活性導(dǎo)向蛋白質(zhì)分析方法——基于同位素標(biāo)記串聯(lián)正交酶水解的活性蛋白質(zhì)分析技術(shù)（isotopic Tandem Orthogonal Protease-activity-based Protein Profiling，isoTOP-ABPP）。首先被應(yīng)用于在全蛋白質(zhì)組范圍內(nèi)定量分析半胱氨酸的反應(yīng)活性。
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isoTOP-ABPP技術(shù)中設(shè)計了一種獨特的探針結(jié)構(gòu)：炔基化的碘乙酰胺（IA-Alkyne）。將其處理蛋白質(zhì)組樣本后，IA（碘乙酰胺）能夠與活性半胱氨酸殘基發(fā)生共價結(jié)合（本質(zhì)是半胱氨酸巰基（-S?）對碘乙酰胺 α-C 的 S?2 親核取代反應(yīng)）。隨后，引入同位素標(biāo)簽“輕（Light）”“重（Heavy）”以區(qū)分實驗組與對照組。再通過點擊化學(xué)將帶有疊氮基團(tuán)的富集標(biāo)簽（Azide-TEV-Biotin）鏈接到活性探針的炔基基團(tuán)（該標(biāo)簽包括：疊氮Azide：與炔基發(fā)生點擊化學(xué)反應(yīng)；生物素Biotin：用于鏈霉親和素磁珠的富集；TEV蛋白酶酶切位點：用于后續(xù)的特異性酶解釋放）。利用鏈霉親和素磁珠處理樣品，再利用TEV蛋白酶進(jìn)行處理，釋放出被標(biāo)記半胱氨酸的肽段，更利于后續(xù)的質(zhì)譜鑒定。最后，通過質(zhì)譜分析，比較輕/重同位素信號的比率（Ratio），就能夠精確判斷出具有反應(yīng)性的半胱氨酸位點。
圖2 isoTOP-ABPP技術(shù)實驗流程導(dǎo)圖
在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊在2013年于《Nature Methods》發(fā)表了題為“A chemoproteomic platform to quantitatively map targets of lipid-derived electrophiles”的另一研究。在該研究中，團(tuán)隊利用“競爭性結(jié)合”這一概念，通過對比分析小分子化合物與探針作用后標(biāo)記信號的改變，來鑒定小分子在細(xì)胞中與靶蛋白結(jié)合的具體半胱氨酸位點。
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不同于之前技術(shù)中化合物對蛋白質(zhì)的直接標(biāo)記，競爭性isoTOP-ABPP先將待研究的小分子化合物處理實驗組樣品，用等量的對照溶劑處理對照組樣品。隨后在兩組中分別加入IA-Alkyne探針進(jìn)行競爭標(biāo)記。最后，通過點擊化學(xué)反應(yīng)及質(zhì)譜分析，比較實驗組與對照組樣品，其中標(biāo)記信號顯著降低的位點即是小分子化合物的潛在結(jié)合位點。
isoTOP-ABPP技術(shù)作為一種“發(fā)現(xiàn)”工具，能夠全局性、無偏倚地繪制化合物在整個蛋白質(zhì)組中所有反應(yīng)性半胱氨酸的活性圖譜。
競爭性isoTOP-ABPP作為一種“篩選”工具，能夠精準(zhǔn)鑒定小分子化合物在復(fù)雜蛋白質(zhì)組中結(jié)合靶蛋白的具體半胱氨酸位點，對于理解藥物作用機制和挖掘潛在副作用具有關(guān)鍵作用。此外，還能夠定量比較同一化合物對于不同靶點結(jié)合位點的占據(jù)效率，以評估其選擇性，為結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供指導(dǎo)。
近年來，隨著相關(guān)研究的推進(jìn)，國際頂級期刊中采用該技術(shù)開展的研究越來越多，其應(yīng)用場景也愈發(fā)廣泛。在這里，小編按照時間順序整理了3篇發(fā)表于CNS正刊中應(yīng)用isoTOP-ABPP技術(shù)的研究文章，和大家一起學(xué)習(xí)。（更多相關(guān)文獻(xiàn)見文末列表）
01 系統(tǒng)性鑒定抗癌藥物靶點，揭示細(xì)胞核-線粒體ROS感應(yīng)通路
2023年5月15日，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊在《Cell》上發(fā)表了題為“Systematic identification of anticancer drug targets reveals a nucleus-to-mitochondria ROS-sensing pathway”的研究文章。
技術(shù)目的：該研究整合活性蛋白組學(xué)及基因篩選等技術(shù)，對11種抗癌藥物誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的內(nèi)在機制展開研究。利用isoTOP-ABPP技術(shù)全局性、無偏向地發(fā)現(xiàn)和定量細(xì)胞內(nèi)成千上萬個半胱氨酸殘基在抗癌藥物處理后的反應(yīng)性變化。該技術(shù)能夠盡可能的捕獲半胱氨酸多種修飾類型（包括氧化、化合物直接修飾、ROS相關(guān)代謝物加合），還能反映初級和次級ROS活性效應(yīng)。
技術(shù)應(yīng)用與結(jié)果：在鑒定出的35656個半胱氨酸和8297個蛋白質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)2910個蛋白質(zhì)中的4980個半胱氨酸存在反應(yīng)性變化（與載體對照相比，iso-TMT比率（R）顯示反應(yīng)性變化≥1.5倍的半胱氨酸）。根據(jù)反應(yīng)性變化模式將半胱氨酸分為4個簇進(jìn)行特征分析（圖3A-B），并通過新開發(fā)的“半胱氨酸反應(yīng)性評分”發(fā)現(xiàn)多種抗癌藥物誘導(dǎo)的半胱氨酸靶點（圖3C-D），為理解藥物機制和開發(fā)新療法提供了關(guān)鍵數(shù)據(jù)支持。
圖3 系統(tǒng)性鑒定抗癌藥物靶點，揭示細(xì)胞核-線粒體ROS感應(yīng)通路
02 蛋白質(zhì)組全范圍鑒定破譯甲醛作用——作為信號傳導(dǎo)劑對于生物合成與一碳代謝的調(diào)控作用
2023年11月2日，美國加州大學(xué)伯克利分校的研究團(tuán)隊在《Science》上發(fā)表了題為“Formaldehyde regulates S-adenosylmethionine biosynthesis and one-carbon metabolism”的研究文章。
技術(shù)目的：該研究發(fā)現(xiàn)了甲醛（FA）與S - 腺苷甲硫氨酸（SAM）作為細(xì)胞中的一碳單位參與代謝與表觀遺傳調(diào)控的重要作用。利用isoTOP-ABPP技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)甲醛能夠特異性且選擇性地修飾蛋白質(zhì)組中特定的半胱氨酸殘基。甲醛作為一種選擇性親電信號分子，通過劑量依賴性方式，特異性結(jié)合 SAM 合成終末酶（MAT1A）的Cys120位點，抑制SAM生成并降低細(xì)胞甲基化潛力。該研究揭示甲醛可通過位點特異性翻譯后修飾調(diào)控細(xì)胞核心代謝，為理解一碳單位間的相互作用及相關(guān)疾病機制提供了新的視角。
技術(shù)應(yīng)用與結(jié)果：研究者使用接近疾病水平濃度的甲醛處理小鼠脾臟裂解液，通過isoTOP-ABPP鑒定出576個對甲醛高度敏感的半胱氨酸位點（圖4A-B），進(jìn)一步分析得知，這些被甲醛修飾的蛋白質(zhì)并非隨機分布，而是顯著富集于與甲醛代謝和一碳代謝相關(guān)的關(guān)鍵通路中（圖4C-D）。證實甲醛應(yīng)被視為一種選擇性親電信號分子，而非非特異性損傷劑，它通過修飾特定功能通路（尤其是一碳代謝）中的關(guān)鍵半胱氨酸殘基來可能調(diào)控細(xì)胞功能。
圖4 蛋白質(zhì)組全范圍鑒定破譯甲醛作為信號傳導(dǎo)劑，對于生物合成與一碳代謝的調(diào)控作用
03 DrugMap：跨癌癥研究中全面鑒定半胱氨酸可配體結(jié)合性
2024年4月22日，麻省總醫(yī)院癌癥中心的研究團(tuán)隊在《Cell》上發(fā)表了題為“DrugMap: A quantitative pan-cancer analysis of cysteine ligandability”的研究文章。
技術(shù)目的：isoTOP-ABPP技術(shù)已推動針對多種癌癥半胱氨酸靶點的共價抑制劑分子的研發(fā)。然而不同致癌背景如何影響半胱氨酸的靶向性仍不明確。由此，研究者開發(fā)了一份涵蓋416種癌細(xì)胞系的半胱氨酸可配體結(jié)合性圖譜——“DrugMap”，并在此基礎(chǔ)上揭示了不同癌癥間半胱氨酸可配體結(jié)合性的異質(zhì)性，明確了驅(qū)動半胱氨酸靶向性的細(xì)胞內(nèi)在特征，并為利用共價探針破壞致癌轉(zhuǎn)錄因子活性提供了實踐范例。
技術(shù)應(yīng)用與結(jié)果：研究者為繪制跨多種癌癥的半胱氨酸可配體性綜合圖譜，選擇了來自25種癌癥亞型（譜系）的416種細(xì)胞系，每個譜系平均由約18個細(xì)胞系代表，較罕見的癌癥也至少由兩個細(xì)胞系覆蓋（圖5A）。隨后利用isoTOP-ABPP與串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（TMT）技術(shù)相結(jié)合，測量半胱氨酸的反應(yīng)性。結(jié)果共定量了78523個半胱氨酸，發(fā)現(xiàn)其中5957個具有可配體性（圖5B）。進(jìn)一步，將數(shù)據(jù)與多組學(xué)信息進(jìn)行整合，并通過新開發(fā)的計算工具——半胱氨酸集富集分析（CSEA）進(jìn)行深入挖掘，最終形成了一個多維度、可交互探索的研究平臺“DrugMap”，為揭示跨癌癥的豐富而詳細(xì)的半胱氨酸可配體研究提供了數(shù)據(jù)支撐，也為未來開發(fā)癌癥靶向藥物提供了可行可用的全新策略（圖5C）。
圖5 DrugMap：跨癌癥研究中全面鑒定半胱氨酸可配體結(jié)合性
總結(jié)與討論
isoTOP-ABPP技術(shù)作為ABPP技術(shù)的一個重大發(fā)展，用于在全蛋白質(zhì)組范圍內(nèi)定量分析藥物作用后半胱氨酸的反應(yīng)活性，極大地推動了藥物靶點發(fā)現(xiàn)、藥物結(jié)合半胱氨酸位點鑒定、全局性地分析藥物-蛋白質(zhì)相互作用圖譜，為基礎(chǔ)生物學(xué)功能研究、發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物以及藥物選擇性和結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供重要指導(dǎo)。
在此基礎(chǔ)上，更多的研究者利用不同的探針或質(zhì)譜方法，開發(fā)出了新的反應(yīng)試劑和分析方法來克服isoTOP-ABPP技術(shù)本身存在的一些局限性，使其應(yīng)用于更加廣泛的研究場景。例如北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院、北大-清華生命聯(lián)合中心王初課題組研究發(fā)展的具有高選擇性和定量準(zhǔn)確性三重定量化學(xué)蛋白質(zhì)方法（rdTOP-ABPP）、具有重現(xiàn)性好，覆蓋度高，定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢的無標(biāo)記定量化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法（DIA-ABPP）等。
近十年里，隨著化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的迅猛發(fā)展，越來越多的ABPP衍生技術(shù)被應(yīng)用于基礎(chǔ)生物學(xué)、藥物發(fā)現(xiàn)和精準(zhǔn)醫(yī)療等多個領(lǐng)域。在推動共價藥物發(fā)展的同時，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中也為我們提供了前所未有的視角。受篇幅限制，達(dá)吉特只能列舉幾篇經(jīng)典案例，其實isoTOP-ABPP以及以競爭ABPP技術(shù)為底層技術(shù)所發(fā)表的頂級刊物文章還有很多，說明ABPP化學(xué)蛋白組及其衍生技術(shù)的準(zhǔn)確性和適用范圍非常廣泛，受到業(yè)界普遍關(guān)注和認(rèn)可。
達(dá)吉特已經(jīng)合成了數(shù)百種炔基和光交聯(lián)基團(tuán)標(biāo)記的小分子，可以支持研究人員在各類細(xì)胞中利用ABPP和isoTOP-ABPP技術(shù)快速釣取疾病相關(guān)特異性功能靶點。
相關(guān)文獻(xiàn)
1.Weerapana E, Wang C, Simon GM, et al. Quantitative reactivity profiling predicts functional cysteines in proteomes. Nature. 2010;468(7325):790-795. doi:10.1038/nature09472
2.Wang C, Weerapana E, Blewett MM, Cravatt BF. A chemoproteomic platform to quantitatively map targets of lipid-derived electrophiles. Nat Methods. 2014;11(1):79-85. doi:10.1038/nmeth.2759
3.Zhang J, Simpson CM, Berner J, et al. Systematic identification of anticancer drug targets reveals a nucleus-to-mitochondria ROS-sensing pathway. Cell. 2023;186(11):2361-2379.e25. doi:10.1016/j.cell.2023.04.026
4.Pham VN, Bruemmer KJ, Toh JDW, et al. Formaldehyde regulates S-adenosylmethionine biosynthesis and one-carbon metabolism. Science. 2023;382(6670):eabp9201. doi:10.1126/science.abp9201
5.Takahashi M, Chong HB, Zhang S, et al. DrugMap: A quantitative pan-cancer analysis of cysteine ligandability. Cell. 2024;187(10):2536-2556.e30. doi:10.1016/j.cell.2024.03.027
6.Vinogradova EV, Zhang X, Remillard D, et al. An Activity-Guided Map of Electrophile-Cysteine Interactions in Primary Human T Cells. Cell. 2020;182(4):1009-1026.e29. doi:10.1016/j.cell.2020.07.001
7.Backus KM, Correia BE, Lum KM, et al. Proteome-wide covalent ligand discovery in native biological systems. Nature. 2016;534(7608):570-574. doi:10.1038/nature18002
8.Yang F, Gao J, Che J, Jia G, Wang C. A Dimethyl-Labeling-Based Strategy for Site-Specifically Quantitative Chemical Proteomics. Anal Chem. 2018;90(15):9576-9582. doi:10.1021/acs.analchem.8b02426
9.Qin W, Qin K, Zhang Y, et al. S-glycosylation-based cysteine profiling reveals regulation of glycolysis by itaconate. Nat Chem Biol. 2019;15(10):983-991. doi:10.1038/s41589-019-0323-5
10.Yang F, Jia G, Guo J, Liu Y, Wang C. Quantitative Chemoproteomic Profiling with Data-Independent Acquisition-Based Mass Spectrometry. J Am Chem Soc. 2022;144(2):901-911. doi:10.1021/jacs.1c11053
達(dá)吉特針對中藥及小分子藥物研究，建立了一套完整的技術(shù)服務(wù)體系：
1）中藥/復(fù)方的有效成分高標(biāo)準(zhǔn)鑒定
2）空間藥物分布與空間藥代動力學(xué)
3）小分子化合物批量標(biāo)記（生物素/炔基/熒光）
4）小分子釣靶（標(biāo)記法）：20K人類蛋白組芯片/ ABPP/競爭性化學(xué)蛋白組
5）小分子釣靶（非標(biāo)記法）：DARTS /Lip-MS/ CETSA
6）膜蛋白靶點篩選技術(shù)：SPIDER / MPA/GPCR膜蛋白芯片
7）藥物調(diào)控通路篩選：磷酸化抗體芯片/磷酸化蛋白組
8）SPR表面等離子共振（分子動力學(xué)）
9）藥-靶結(jié)合位點分析（高分辨質(zhì)譜/分子對接）
10）細(xì)胞、小動物活體成像
11）表型篩藥：Drug-seq分子表型篩藥、類器官篩藥、高內(nèi)涵篩藥
12）以靶找藥：虛擬篩選+HSPR