New Phytol.(IF=8.1)｜安農大宋傳奎教授團隊最新研究刷新認知！甜菜堿竟能“解鎖”茶樹抗寒密碼？
英文標題：Glycoside-speci?c metabolomics reveals the novel mechanism of glycinebetaine-induced cold tolerance by regulating apigenin glycosylation in tea plants
中文標題：糖苷特異性代謝組學揭示了甜菜堿通過調節芹菜素糖基化誘導茶樹抗寒的新機制
發表期刊：New Phytologist
影響因子：8.1
研究背景
茶樹(Camellia sinensis)因其豐富的次生變質巖而被公認為世界上最重要的經濟作物之一，主要生長在溫暖潮濕的熱帶和亞熱帶地區。但近年來，全球氣候變化導致早春冷害和凍害頻發，明顯制約了其生長發育和生態分布，從而阻礙了茶業的可持續發展。當植物經歷冷脅迫時，它們的代謝物發生修飾，包括甲基化和糖基化，這在調節溶解度、穩定性、以及各種次生代謝物的生物活性，這與植物對冷脅迫的耐受性有著復雜的聯系。糖基化是脅迫下影響次生代謝產物的關鍵修飾，受甘氨酸甜菜堿(Glycinebetaine, GB)影響，調控植物的抗逆性。然而，糖苷的復雜性和檢測挑戰阻礙了應激下其與GB代謝相互作用的調節機制的理解。
近期，安徽農業大學宋傳奎教授團隊在New Phytologist上發表了題為"Glycoside-specific metabolomics reveals the novel mechanism of glycinebetaine-induced cold tolerance by regulating apigenin glycosylation in tea plants"的研究論文。該研究開發了一種利用錐孔電壓誘導源內裂解的糖苷特異性代謝組學方法，揭示了GB通過調節芹菜素糖苷化誘導茶樹耐寒性的新機制，拓寬了對糖苷化在植物抗寒作用的理解。
研究結果
茶樹糖苷特異性代謝組學方法的建立
糖基化導致代謝物底物分子量增加，當應用CV誘導源內解離時，糖苷在底物和糖苷修飾基團之間的鍵處發生解離。隨后，采用高分辨率質譜分析儀同時檢測糖苷的前體離子和片段離子（即苷元），從而產生特定的NL值（圖1a-c）。基于這一原理，本研究首先通過標準品確定了能誘導糖苷源內解離的初始CV。研究發現，當CV從40V增加到50V時，前體離子及其二聚體對兩種標準樣品的響應值均略有增加，這表明較高的CV有利于更多離子的進入（圖1d）。然而，還觀察到苷元離子和其他片段的響應值顯著增加，表明這兩種苷在CV=50V時開始進行源內解離。山奈酚-3-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-新橙皮苷和牡荊素-2-O-鼠李糖苷的鍵解離模式與槲皮素7-O-葡萄糖苷非常相似(圖1e)。因此，推斷CV=40V代表糖苷源內解離的閾值。在確定初始CV之后，進一步研究了茶樹中糖苷源內解離最大化的CV范圍。因此，在 50、60、70、80和90V的CV下觀察四種標準品的鍵解離模式，以確定最適CV范圍。結果表明，當CV從40V增加到70V時，槲皮素7-O-葡萄糖苷的響應略有增加，而其二聚體的響應略有下降。將CV從70增加到90V，槲皮素7-O-葡萄糖苷的響應相對穩定，而其二聚體的響應明顯下降。同時，還觀察到大量苷元離子的產生(M-H-NL=301.0374)，表明在此CV范圍內，糖苷發生了相當大的源內解離，二聚體的解離有助于前體離子的產生，從而穩定了槲皮素7-O-葡萄糖苷的響應值（圖1d）。山奈酚-3-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-新橙皮苷和牡荊素-2-O-鼠李糖苷的鍵解離模式與槲皮素7-O-葡萄糖苷的鍵解離模式非常相似(圖1e)，表明這兩種標準物在該CV范圍內都發生了相當大的源內解離。因此，本實驗的CV范圍被確定為40-90V。綜上，本實驗設定初始CV為40V，并在該電壓下對單個樣品進行常規全局代謝分析。CV范圍確定為40-90V，且以5V為增量進行梯度設置。
圖1 茶樹糖苷特異性代謝組學策略
用CsBADH1評價糖苷特異性代謝組學方法的效率
通過鑒定顯著差異代謝物來評估苷特異性代謝組學的效率，并利用該方法闡明冷響應基因CsBADH1對茶樹糖苷的調控作用。結果顯示，常規全局代謝組學分析從茶苗提取物中檢測到超過4000種獨特的可量化代謝物特征。具體而言，在ESI+模式下鑒定出2147個特征，在ESI-模式下鑒定出1941個特征（圖2a）。對CsBADH1沉默和對照茶苗的代謝譜進行單變量分析，發現超過1000個代謝物特征，與之形成鮮明對比的是，糖苷特異性代謝分析僅鑒定出不到200個糖苷離子，其中ESI+模式下有65個，ESI-模式下有124個（圖2b）。單因素分析表明，CsBADH1沉默的茶苗中70個糖苷離子的水平發生顯著變化。在CsBADH1沉默的茶樹中，預計發生顯著變化的70個糖苷離子包括28個單糖苷、21個雙糖苷和21個三糖苷（圖2b）。這些結果表明，苷特異性代謝組學分析可同時鑒定具有不同糖數量和糖類型的多種糖苷。當對同一化合物進行不同糖苷修飾的重復計數時，候選糖苷離子的總數減少到60個。因此，與傳統的全局代謝組學相比，糖苷特異性代謝分析大大減少了未知代謝物的數量，并將目標離子范圍縮小了94.3%。在源內解離過程中，具有特定分子量的代謝物的糖基化可以通過中性丟失(NL)途徑消除，從而產生獨特的NL模式。G1的中性丟失為m/z=162.0424(Δ=0.104)，表明其發生了糖基化（圖1c）。根據MS/MS譜圖，從先前鑒定并確認為糖苷的60個候選離子中選擇了15個糖苷離子（圖2c）。在這15個糖苷離子中，9個為單糖基化，包括葡萄糖基化/半乳糖基化、鼠李糖基化以及阿拉伯糖基化/木糖基化。
圖2 通過CV誘導源內解離準確表征茶樹中的糖苷
CsBADH1通過調節冷響應性糖苷來調節耐寒性
為了研究CsBADH1在低溫脅迫下茶樹中的可能作用，分析了4℃低溫馴化0、1、3、5和7d茶樹中CsBADH1基因的表達水平和相對GB含量。CsBADH1的表達水平在4℃下顯著上調，并隨冷暴露時間持續上調。相應地，GB含量也呈現相似趨勢（圖3a）。這些結果表明，CsBADH1可能參與茶樹的GB生物合成和冷脅迫響應。為了進一步研究CsBADH1在茶樹中的功能，我們首先獲得了純化的BADH酶，并通過合適的酶催化反應體系，在體外確定了其誘導GB合成的功能（圖3b）。隨后，用CsBADH1沉默的茶樹進行耐冷性測定。結果表明，CsBADH1沉默植株對冷脅迫表現出顯著的敏感性表型，CsBADH1表達量和GB含量顯著降低(圖3c-e)。葉片光合活性顯著低于非沉默植株，FV/FM值也顯著降低(圖3f)。這些結果表明，CsBADH1參與GB的生物合成，并積極調節茶樹的耐寒性。緊接著，對因CsBADH1沉默而發生顯著變化的糖苷與低溫誘導發生顯著變化的化合物進行了相關性分析。取兩者的交集，共篩選出9個同時受CsBADH1和低溫誘導變化的苷類化合物(圖3g)。其中，一個糖苷離子(m/z=579.1708)在CsBADH1沉默植株中比非沉默植株顯著上調，且在低溫處理植株中與室溫對照植株相比也呈顯著上調趨勢。其中，一個糖苷離子(m/z=579.1708)在CsBADH1沉默植株中比非沉默植株顯著上調，且在低溫處理植株中與室溫對照植株相比也呈顯著上調趨勢。然后通過將糖苷離子與假定的糖苷標準物進行比較，確定糖苷離子為異野漆樹苷(圖3h)。色譜圖進一步表明，與非沉默組相比，沉默CsBADH1導致茶樹中異野漆樹苷含量顯著增加(圖3i)。最后，對茶葉進行外源GB噴施處理，結果表明，噴施GB后，茶樹內源GB含量顯著增加，異野漆樹苷含量呈下降趨勢(圖3j-k)。總體而言，CsBADH1可以上調GB水平，下調異野漆樹苷水平，同時正向調節茶樹的耐寒性
圖3 發現同時對甜菜堿醛脫氫酶(CsBADH1)和冷反應的糖苷
CsBADH1介導的冷響應糖苷、異野漆樹苷及其前體芹菜素在茶樹耐寒性中的作用
為了研究鑒定到的糖苷在寒冷脅迫下茶樹中的潛在作用，首先確定了異野漆樹苷及其前體芹菜素對寒冷的響應模式。DESI-MS分析結果直觀地顯示，冷處理后，芹菜素和異野漆樹苷的離子響應值呈現明顯上升趨勢(圖4a)，說明兩者均為冷反應代謝物。隨后，為了進一步闡明兩者對低溫的反應，對茶樹進行了外源噴灑異野漆樹苷及其前體芹菜素和耐寒性實驗。結果顯示，噴施異野漆樹苷導致內源異野漆樹苷在茶葉中積累，導致茶葉出現冷敏表型，FV/FM值顯著降低(圖4b-d)。噴施芹菜素能顯著提高茶樹內源芹菜素水平(圖4e)，但對茶樹的表型沒有顯著影響，略微提高FV/FM值(圖4b-c)，表明芹菜素正向調控茶樹的耐冷性。為了進一步證明芹菜素在低溫脅迫下對茶樹的作用，對芹菜素合成的關鍵基因FNS進行了基因沉默處理，然后進行了耐寒性試驗。結果顯示，FNS沉默植株對冷脅迫表現出明顯的敏感性表型，FNS表達水平和芹菜素含量顯著降低(圖4f-h)。葉片光合活性顯著低于非沉默植株，FV/FM值顯著降低(圖4i)。這些結果表明，FNS介導的芹菜素生物合成對茶樹的耐寒性有積極的調節作用。
圖4 異野漆樹苷及其前體芹菜素在茶樹耐寒性中的作用
GB和芹菜素通過減輕ROS損傷增強冷脅迫耐受性
已有研究表明，GB和芹菜素具有一定的抗氧化作用，能夠清除自由基和活性氧(ROS)，且與植物的脅迫耐受性相關。在此基礎上，進一步驗證了GB、芹菜素和異野漆樹苷是否能通過清除ROS和增強抗氧化活性來提高茶樹的耐寒性。結果顯示，CsBADH1沉默植株對冷脅迫表現出顯著的敏感表型，O??和MDA含量顯著增加，而總抗氧化能力(T-AOC)顯著降低（圖5a），表明GB可通過清除ROS和增強抗氧化活性來提高茶樹的耐冷性。芹菜素和異野漆樹苷噴施實驗結果顯示，噴施異野漆樹苷可導致H?O?和O??積累，而噴施芹菜素顯著減少H?O?積累，并提高T-AOC(圖5b)。這表明芹菜素可以通過清除ROS和增強抗氧化活性來提高茶樹的耐寒性，而異野漆樹苷則不具有這一功能。FNS沉默實驗顯示，FNS沉默植株中H?O?和O??的積累顯著增加，同時T-AOC顯著降低，并伴隨MDA積累，這也支持上述結論（圖5c）。
圖5 甜菜堿(GB)、異野漆樹苷及其前體芹菜素對低溫脅迫下茶樹活性氧清除和抗氧化活性的影響
研究結論
本研究建立的苷特異性代謝組學方法為植物糖苷檢測及相關代謝研究提供了高效工具，可擴展用于其他代謝物修飾分析。并且首次揭示GB通過調控芹菜素糖基化介導茶樹耐冷性的機制，拓寬了對植物次生代謝（尤其是糖基化）在耐冷性中作用的認知。為茶樹耐冷品種培育、低溫防控技術研發提供理論依據，GB和芹菜素有望作為綠色調節劑應用于農業生產。
甜菜堿（GB）通過調節芹菜素糖基化誘導耐寒的新機制
END
Tang 撰文
Weyne 校稿