CAR-T細(xì)胞治療全流程，包括采集病患或者健康供體的外周血單核細(xì)胞（PBMC）、T細(xì)胞分離激活，T細(xì)胞體外基因修飾，CAR-T細(xì)胞體外擴(kuò)增，CAR-T細(xì)胞質(zhì)量監(jiān)控，CAR-T細(xì)胞回輸病患體內(nèi)這六個(gè)主要步驟。

圖1 CAR-T細(xì)胞治療工作流程的示意圖^[3]

采集病患或健康供體的外周血單核細(xì)胞（PBMC）是CAR-T生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵步驟之一。供體選擇時(shí)，病患供體需考慮其身體狀況及免疫細(xì)胞數(shù)量是否足夠。健康供體需經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的健康篩查，確保無(wú)傳染病風(fēng)險(xiǎn)。注意操作規(guī)范和質(zhì)量控制，并符合倫理與法律規(guī)定。

CAR-T細(xì)胞的產(chǎn)生始于通過(guò)單采或外周靜脈血收集患者的外周血單核細(xì)胞（PBMC）。由于PBMC的組成差異很大，為保證盡量獲得一致的CART細(xì)胞，需要利用基于磁珠的技術(shù)分離出特定的T細(xì)胞亞群，如CD4+、CD8+、CD62L+或CD45RO+ T細(xì)胞。

許多研究表明，T細(xì)胞亞群的選擇是CAR-T細(xì)胞治療效果的基礎(chǔ)。在這方面，中央記憶T細(xì)胞（TCM）的CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)似乎對(duì)體內(nèi)有效的細(xì)胞擴(kuò)張、存活和持久性至關(guān)重要^[4]。此外，選擇幼稚或分化程度較低的CD8+T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)可以使輸注后T細(xì)胞增殖和體內(nèi)持久性增加。

無(wú)論是否采用了T細(xì)胞分離過(guò)程，都需要T細(xì)胞活化步驟來(lái)進(jìn)行充分的轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，使用抗CD3和CD28抗體或固定化的CD3和CD28抗體刺激激活T細(xì)胞。固定化的抗CD3抗體提供更好的T細(xì)胞交聯(lián)和活化，而CD28抗體可激活靶細(xì)胞中的共刺激信號(hào)通路。

圖2 抗CD3/CD28抗體激活T細(xì)胞原理示意圖

CD3/CD28抗體偶聯(lián)磁珠憑借其高效性和穩(wěn)定性，成為行業(yè)主流選擇。磁珠表面偶聯(lián)抗CD3和CD28抗體，分別結(jié)合TCR/CD3和CD28受體，提供初級(jí)和共刺激信號(hào)，模擬天然APC的激活機(jī)制，并且通過(guò)磁場(chǎng)分離磁珠，避免傳統(tǒng)APC培養(yǎng)的復(fù)雜性，且無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞需求，為臨床申報(bào)提供極大便利性。

近岸蛋白為CGT客戶提供GMP級(jí)CD3/CD28 beads(Cat. No.:GMP-B016)，選用直徑為 4.5μm的無(wú)孔單分散超順磁性微珠，易于磁化和退磁，操作簡(jiǎn)便易去除，確保無(wú)磁殘留風(fēng)險(xiǎn)；Anti-CD3抗體是通過(guò)成品藥 OKT3 人源化改造而成，靶向 CD3ε；Anti-CD28抗體可以激活 T 細(xì)胞共刺激分子 CD28。

Expansion of the human PBMCs. Cells were stimulated with Anti- Human CD3/CD28 Beads (Cat. No. :GMP-B016) , and expanded for 14 days.

（2）激活第5天，細(xì)胞活化增殖占比99%以上

The human PBMCs were labeled with CFSE and stimulated with Anti- Human CD3/CD28 Beads, and then the proliferation of cells was assessed with CFSE dilution assay by flow Cytometry on day 5 after stimulation.

（3）激活后PD-1表達(dá)情況

A.mRNA用于T細(xì)胞的基因修飾：

近幾年,mRNA技術(shù)快速發(fā)展，除了在傳染病疫苗領(lǐng)域快速發(fā)展，在腫瘤治療領(lǐng)域也逐漸凸顯出其優(yōu)勢(shì)。通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄修飾獲得的轉(zhuǎn)座子及CRISPR/Cas9系統(tǒng)等mRNA，已被成功用于T細(xì)胞基因編輯。

近岸蛋白提供全套mRNA體外轉(zhuǎn)錄及修飾用酶及試劑，產(chǎn)品符合GMP級(jí)生產(chǎn)及質(zhì)量管理體系，已助力多家企業(yè)mRNA疫苗進(jìn)入臨床階段。所有酶產(chǎn)品通過(guò)FDA DMF備案，為客戶中美雙報(bào)打下基礎(chǔ)。除酶原料產(chǎn)品外，近岸蛋白還提供自序列設(shè)計(jì)到LNP包封的高通量篩選CRO服務(wù)，為初建mRNA技術(shù)平臺(tái)的客戶提供快速解決方案。

圖3 近岸蛋白R(shí)NA原料及服務(wù)助力解鎖體內(nèi)CAR-T新療法

目前已有幾種成熟的基因轉(zhuǎn)移平臺(tái)，可用于將嵌合抗原受體（CAR）基因引入原代T細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因插入可以通過(guò)病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、mRNA轉(zhuǎn)染，睡美人轉(zhuǎn)座子、piggyBac轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒DNA的非病毒轉(zhuǎn)染來(lái)進(jìn)行。在臨床基因轉(zhuǎn)移應(yīng)用中，病毒載體是在靶細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)感興趣基因穩(wěn)定表達(dá)或基因表達(dá)突變的主要手段。

圖5 rAAV病毒載體生產(chǎn)流程示意圖^[6]

在病毒載體的大規(guī)模生產(chǎn)純化過(guò)程中，核酸殘留成為各類質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的重中之重，因?yàn)镈NA較好的穩(wěn)定性，容易在生產(chǎn)過(guò)程中形成殘留，而最終的生物制品應(yīng)用到人類疾病預(yù)防和治療時(shí)，會(huì)帶來(lái)不可控的危險(xiǎn)因素。對(duì)于病毒載體在生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的核酸，現(xiàn)在大多選擇核酸酶進(jìn)行去除。

近岸蛋白質(zhì)提供GMP條件下生產(chǎn)的全能核酸酶（BenzoNuclease），無(wú)動(dòng)物源性，無(wú)氨芐青霉素，可高效降解單鏈、雙鏈、線性、環(huán)狀、超螺旋等任何形式的DNA及RNA。質(zhì)量、性能、供貨能力可靠，并已完成FDA DMF備案，可以滿足藥物申報(bào)的規(guī)范。同時(shí)提供高性能配套全能核酸酶殘留檢測(cè)試劑盒（檢測(cè)范圍0.014-10ng/ml），靈敏度高。

不管是原代T細(xì)胞還是通過(guò)基因修飾獲得的CAR-T細(xì)胞，都需要進(jìn)行大規(guī)模的體外擴(kuò)增，才能獲得達(dá)到后續(xù)環(huán)節(jié)以及治療所需劑量。

已有大量文獻(xiàn)指出，細(xì)胞因子IL-2/IL-7/IL-15在T細(xì)胞增殖、T細(xì)胞亞群的生長(zhǎng)以及提高CAR-T產(chǎn)品療效和持久性方面發(fā)揮重要作用。

Hopkins B等人進(jìn)行了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究不同組合IL-2、IL-7、IL-15對(duì)T細(xì)胞亞群生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，CD4+和CD8+ naïve T細(xì)胞分別在中等濃度的IL-2和IL-7組合以及IL-7作用下可以有效生長(zhǎng)。CD4+和CD8+記憶細(xì)胞分別在中等濃度IL-2和IL-15組合以及中等濃度IL-7和IL-15組合中有利^[5]。Coppola C等研究結(jié)果表明IL-2和IL-7在促進(jìn)活化的CD4+ T細(xì)胞的最佳增殖和存活方面存在協(xié)同作用^[7]。

近岸蛋白提供GMP級(jí)IL-2/IL-7/IL-15細(xì)胞因子產(chǎn)品，且已通過(guò)FDA DMF備案。如果您使用了近岸蛋白的DMF備案系列產(chǎn)品并需要引用DMF編號(hào)，點(diǎn)擊下方按鈕提出授權(quán)申請(qǐng)，我們收到申請(qǐng)后，將向FDA提供DMF授權(quán)書(shū)。

（1）活性數(shù)據(jù)

Measured in a cell proliferation assay using PHA-activated human peripheral blood lymphocytes (PBL). The ED50 for this effect is 168.10 pg/ml.The specific activity of Recombinant human IL-7 is > 1.0 × 10⁸ IU/mg, which is calibrated against human IL-7 WHO International Standard (NIBSC code: 90/530)

（2）批間穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

Three independent lots were tested for activity and plotted on the same graph to show lot-to-lot consistency of IL-7.

目前，細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制分為四個(gè)大的方面，分別為安全性、純度、效力以及均一性，這些質(zhì)量控制會(huì)貫穿CAR-T生產(chǎn)的各個(gè)階段。

其中CAR-T的均一性和純度主要指目標(biāo)細(xì)胞（CAR陽(yáng)性T細(xì)胞）所占的比例。目前有針對(duì)CAR不同結(jié)構(gòu)區(qū)域的檢測(cè)方法，包括針對(duì)CAR抗原結(jié)合位點(diǎn)的（如CD19抗原或抗scFv抗體），和針對(duì)輕鏈或鉸鏈區(qū)的（如抗Fab抗體或Protein L）。

近岸蛋白提供CARTEST^® Human CD19-PE Kit(Cat. No.:CT19P)可用于CAR陽(yáng)性率檢測(cè)。此方法利用抗原-抗體特異性反應(yīng)，可有效降低使用Protein L檢測(cè)ScFv存在假陽(yáng)性率高的問(wèn)題，使得數(shù)據(jù)更加真實(shí)可靠。

CARTEST^®Human CD19-PE Kit detects the positive rate of anti-CD19 CAR-CHO cells.Add 5 µL of CD19-PE solution to a suspension of 5×10⁵ cells to be tested, and incubate at 2-8°C in the dark for 30 minutes. Red indicates CAR-negative cell staining results with a false-positive rate of less than 0.5%; blue represents CD19-CAR-positive cell staining results showing a positivity rate of more than 98%.

此外，近岸蛋白還可以提供多種類型的CAR-T陽(yáng)性率檢測(cè)試劑盒和靶點(diǎn)抗原，可用于CAR-T陽(yáng)性率檢測(cè)。

CAR-T陽(yáng)性率檢測(cè)試劑盒:

CAR-T靶點(diǎn)抗原：

最終，經(jīng)質(zhì)量監(jiān)控合格達(dá)到足夠數(shù)量的的CAR-T細(xì)胞，經(jīng)過(guò)最后的末端工藝以及細(xì)胞凍存，即可回輸病人體內(nèi)。

以上便是常規(guī)CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的簡(jiǎn)易制備流程。無(wú)論使用何種制造模式，成功的CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)依賴于整體流程的優(yōu)化。其中所用原料/輔料的合規(guī)、高品質(zhì)十分重要。近岸蛋白提供符合CAR-T臨床制備需求的一系列GMP產(chǎn)品，包括GMP級(jí)重組CD3抗體／CD28抗體、GMP級(jí)CD3/CD28 beads、GMP級(jí)mRNA原料酶、GMP Cas9/AaCas12b^Max/enCas12hf/enCas12Ultra蛋白、GMP級(jí)全能核酸酶、GMP級(jí)細(xì)胞因子（如IL-2/IL-7/IL-15）等，歡迎垂詢！