自20世紀(jì)80年代凱利·穆利斯發(fā)明第一代PCR技術(shù)以來，“變性、退火、延伸”這三個簡單的步驟，歷經(jīng)三十多年的蓬勃發(fā)展，如今，PCR技術(shù)已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的基礎(chǔ)研究工具，廣泛應(yīng)用于基因擴(kuò)增、基因檢測、基因編輯等多個領(lǐng)域。本文將為您詳細(xì)介紹一代PCR的常見類型及其應(yīng)用，助力您的科學(xué)研究。
常規(guī)PCR
常規(guī)PCR一般是由Taq DNA聚合酶介導(dǎo)的PCR反應(yīng)，操作較為簡便，產(chǎn)物帶有A尾。通過瓊脂糖凝膠電泳對終產(chǎn)物進(jìn)行定性和半定量分析。兼容樣本范圍廣，但保真性低，主要應(yīng)用于常規(guī)重組質(zhì)粒驗證和基因型鑒定等方面。
常規(guī)PCR產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱：2×PCR Master Mix (With Dye) 2×常規(guī)PCR預(yù)混液（含染料）（N132002）
產(chǎn)品特點：
1）基礎(chǔ)PCR，分子實驗必備。
2）適用于菌液PCR和基因鑒定。
3）擴(kuò)增出來的產(chǎn)物均是3端帶A的，同時均具有5’-3’外切酶活性。
高保真PCR
高保真PCR一般是由保真性較高的DNA聚合酶介導(dǎo)的PCR反應(yīng)。第一代高保真DNA聚合酶是從棲熱原始菌Pyrococcus furiosus中獲得的具有校正功能的pfu酶，與常規(guī)Taq酶相比多了一種3’-5’的核酸外切酶活性（Proofreading活性），保真性大大提高且擴(kuò)增的產(chǎn)物通常為平末端。目前主要有2類產(chǎn)品：一類是混合型的高保真酶，將帶有Proofreading活性的酶與普通Taq酶混合用于提高擴(kuò)增效率；另一類是單一型的高保真酶，保真性更高。
高保真PCR產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱：2× High-Fidelity PCR Master Mix (With Dye) 2×一代高保真PCR預(yù)混液（含染料）（N132014）
產(chǎn)品特點：
1）高保真PCR，83倍Taq。
2）超高特異性。
3）高性價比。
圖1. 對不同GC模板均能有效擴(kuò)增
熱啟動PCR
熱啟動PCR，也稱Hotstart PCR。指通過一定條件將DNA聚合酶與其他PCR反應(yīng)物隔絕，使其低溫條件下無活性，高溫加熱后釋放酶活，進(jìn)而避免出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物的PCR反應(yīng)。熱啟動PCR的關(guān)鍵是熱啟動型的DNA聚合酶，一般通過抗體、配體或化學(xué)修飾等來封閉酶活性中心，不同的熱啟動修飾方法原理上有所區(qū)別，各有優(yōu)劣勢（見下表）。通常應(yīng)用于復(fù)雜模板、低拷貝基因擴(kuò)增，也是IVD試劑的核心原料。
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化學(xué)修飾 |
配體修飾 |
抗體修飾 |
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原理 |
低溫下，化學(xué)小分子和DNA聚合酶活性中心結(jié)合，酶無活性；溫度升高至變性溫度，兩者脫離，酶活性中心暴露，此時，聚合酶發(fā)生聚合反應(yīng)。 |
核酸適配體通過非共價鍵作用與聚合酶結(jié)合，進(jìn)而抑制聚合酶在非許可溫度下的聚合反應(yīng)。 |
高溫變性前，抗Taq抗體與Taq酶結(jié)合，抑制聚合酶活性。溫度升高至變性溫度，抗Taq抗體變性失活，聚合酶發(fā)生聚合反應(yīng)。 |
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優(yōu)點 |
酶活性維持更加穩(wěn)定且無任何外源DNA污染，性價比較高。 |
酶激活時間短，保證酶活。 |
酶激活時間短，保證酶活，親和力強(qiáng)，靈敏度高。 |
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缺點 |
酶激活時間較長，可能會影響酶的活性，導(dǎo)致 PCR 產(chǎn)物的產(chǎn)量降低。 |
核酸配體是一種可逆抑制劑，不如化學(xué)修飾法穩(wěn)定，特異性不夠強(qiáng)。 |
抗體修飾是一種動態(tài)平衡，不如化學(xué)修飾法穩(wěn)定，價格更貴。 |
熱啟動PCR產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱：2×HotStart Fast PCR Master Mix (With Dye) 2×熱啟動快速PCR預(yù)混液（含染料）（N132001）
產(chǎn)品特點：
1）快至1sec/kb。
2）兼容70%GC、長10kb片段。
3）十余物種數(shù)百個片段驗證高特異、高檢出，菌P亦適用。
圖2. 對不同物種檢測結(jié)果
直擴(kuò)PCR
直擴(kuò)PCR技術(shù)，是以未經(jīng)基因組純化的微量原始樣本或其裂解產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。廣泛適用于血液樣本、植物和動物等組織，與常規(guī)PCR相比，樣本用量少、操作簡單、實驗成本低、可高通量化操作?？蓱?yīng)用于基因分型、轉(zhuǎn)基因鑒定等實驗。
Arcegen直擴(kuò)PCR系列產(chǎn)品運用獨特的裂解體系，快速裂解樣品，裂解液可直接作為模板，搭配試劑盒中的具有超強(qiáng)抑制物耐受性的Taq DNA聚合酶進(jìn)行基因的高效擴(kuò)增。
圖3.組織直擴(kuò)系列流程圖
小鼠直擴(kuò)PCR產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱：Mouse Tissue Direct PCR Kit (With Dye) 小鼠組織直接PCR試劑盒（N132021）
產(chǎn)品特點：
1）樣本需要量少：5mg鼠組織或1-5mm鼠尾。
2）模板制備更方便：無需研磨，無需精提純化gDNA。
3）優(yōu)化的PCR體系：具有更高的特異性、更強(qiáng)的 PCR 反應(yīng)抑制物耐受性。
圖4.適合不同類型的小鼠粗提組織
多重PCR
多重PCR，也稱復(fù)合PCR。反應(yīng)原理、反應(yīng)過程與常規(guī)PCR無異，需要在同一個PCR反應(yīng)體系中，使用多對引物對多個基因同時進(jìn)行擴(kuò)增。理論上只要PCR擴(kuò)增的條件合適，引物對的數(shù)量可以不限，但實際由于各種條件的限制，實際能夠擴(kuò)增的產(chǎn)物有限。多重PCR反應(yīng)體系的組成和PCR循環(huán)的條件需經(jīng)過優(yōu)化以確保同時擴(kuò)增多個片段。具有高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟(jì)簡便性，難點是反應(yīng)體系各組分的平衡。主要用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定某些病原微生物、某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。
圖5.多重PCR原理圖
多重PCR產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱：Multiplex qPCR Probe Master Mix 通用多重qPCR探針法預(yù)混液（N132041）
產(chǎn)品特點：
1）兼容5重，靈敏度高達(dá)500copies/mL。
2）可耐受0.5%體積全血。
3）支持快速程序，1h內(nèi)完成結(jié)果檢測。
4）24個月實時穩(wěn)定檢測合格，反復(fù)凍融性能穩(wěn)定。
圖6.相對于競品，更高的檢出率
巢式PCR
巢式PCR是指利用兩對引物進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)。首先使用目的片段外圍的引物對模板進(jìn)行擴(kuò)增，然后使用內(nèi)部的巢式引物同時將第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為第二輪擴(kuò)增的模板。第二次PCR擴(kuò)增得到的目的片斷短于第一次擴(kuò)增。翌圣GMyc-PCR 支原體檢測試劑盒基于支原體16S-23S rRNA序列保守區(qū)域利用巢式PCR法原理可精確檢測到常見的支原體污染。主要應(yīng)用于病毒檢測、測序分析、低表達(dá)基因檢測等。
降落PCR
降落PCR，又稱Touch-down PCR。通過設(shè)置PCR程序中的退火溫度，一般開始時高于預(yù)設(shè)的Tm值，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，退火溫度逐漸降低到Tm值，并最終低于該溫度進(jìn)行PCR反應(yīng)。通過反應(yīng)程序中退火溫度的設(shè)置，極大程度上降低了引物與模板的非特異性結(jié)合。主要用于PCR反應(yīng)程序的優(yōu)化，提高產(chǎn)物特異性。
常見的PCR類型介紹就到這里了。當(dāng)然，除了上述介紹的PCR形式，還有錨定PCR、原位PCR等不同的PCR類型，如感興趣可自行查閱。
產(chǎn)品訂購
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產(chǎn)品應(yīng)用 |
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號 |
規(guī)格 |
目錄價 |
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常規(guī)PCR |
N132002E |
1 mL |
40.00 |
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N132002S |
5×1 mL |
150.00 |
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N132002M |
50×1 mL |
1200.00 |
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N132002L |
100×1mL |
2000.00 |
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高保真PCR |
N132014S |
1 mL |
350.00 |
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N132014M |
5×1 mL |
1350.00 |
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N132014L |
100×1 mL |
19000.00 |
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熱啟動PCR |
2×HotStart Fast PCR Master Mix (With Dye) |
N132001E |
1 mL |
60.00 |
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N132001S |
5×1 mL |
250.00 |
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N132001M |
50×1 mL |
2000.00 |
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N132001L |
100×1mL |
3500.00 |
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直擴(kuò)PCR |
Mouse/Tissue Direct PCR Kit (With Dye) |
N132021E |
50 T |
300.00 |
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N132021S |
200 T |
900.00 |
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多重PCR |
N132141E |
1 mL |
1200.00 |
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N132141S |
5×1 mL |
5200.00 |
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N132141M |
20 mL |
19200.00 |