想精準(zhǔn)誘導(dǎo)RAW264.7成為促炎的M1“戰(zhàn)士”或抗炎的M2“修復(fù)者”？別找了！這份保姆級、超詳細的RAW264.7細胞M1/M2極化方案，從試劑配比到操作細節(jié)，一次性打包給你！
01 必備材料清單
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細胞：RAW264.7小鼠單核巨噬細胞系
注意：傳代次數(shù)不宜過多，建議<10代
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培養(yǎng)基：高糖DMEM
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血清：胎牛血清(FBS)，推薦使用10%
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抗生素：青霉素-鏈霉素雙抗溶液(1%)
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關(guān)鍵誘導(dǎo)劑：
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溶劑對照：PBS或細胞培養(yǎng)基（用于溶解凍干誘導(dǎo)劑的溶劑）
注意：所有細胞因子、LPS建議分裝后-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融！使用前務(wù)必在冰上或4℃緩慢溶解，并用預(yù)冷的培養(yǎng)基或PBS稀釋至工作濃度。
02 實戰(zhàn)操作步驟[1,2] (以6孔板為例)
- 消化處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，用含10%FBS和1%雙抗的完全DMEM培養(yǎng)基制成單細胞懸液。
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（關(guān)鍵步驟）將細胞以2~3x105cells/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基
注意：密度過低影響狀態(tài)，過高可能導(dǎo)致接觸抑制或自發(fā)分化
- 放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜（約16-24小時），讓細胞充分貼壁。
- 確認細胞貼壁良好，約60-70%匯合度為最佳誘導(dǎo)窗口期。
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小心吸棄孔內(nèi)舊培養(yǎng)基。
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(可選步驟)：加入1-2mL預(yù)熱的PBS，輕輕洗滌細胞表面。
注意：此步可去除殘留血清及代謝廢物
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更換極化培養(yǎng)基：
M1組：每孔加入2mL含100ng/mL的LPS+20ng/mL的IFN-γ的完全培養(yǎng)基。
M2組（M2a為例）：每孔加入2mL含20ng/mL的IL-4和20ng/mL的IL-13（可選項）的完全培養(yǎng)基。
對照組1-未處理：只加2mL新鮮完全培養(yǎng)基
對照組2-溶劑對照：加入含有誘導(dǎo)劑等體積溶劑的完全培養(yǎng)基。（排除溶劑本身的影響）
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37℃,5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。
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24小時是最常用且效果顯著的標(biāo)準(zhǔn)時間點。
注意：根據(jù)具體實驗?zāi)康?如檢測早期/晚期基因、蛋白分泌)，可調(diào)整至6、12、48或72小時，但需預(yù)實驗驗證。
誘導(dǎo)后24小時，可以通過以下方法驗證極化表型：
Western Blot/ELISA（蛋白提取）：加入適量預(yù)冷的RIPA裂解液（含蛋白酶/磷酸酶抑制劑)，冰上裂解，收集裂解液。
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Western Blot：檢測iNOS，Arg1，CD206等關(guān)鍵蛋白表達水平
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ELISA：檢測上清液中TNF-α，IL-6(M1)，CCL17，CCL22 (M2a) 等細胞因子的分泌水平
流式細胞術(shù)：用不含EDTA的胰酶消化（輕柔，時間不宜過長）或細胞刮收集細胞，用預(yù)冷的PBS（含1-2%FBS）洗滌1-2次，重懸于適量緩沖液中染色。
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M1表面標(biāo)志物：CD86，MHC-II等表達上調(diào)。
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M2表面標(biāo)志物：CD206，CD163等表達上調(diào)。
免疫熒光：在孔板內(nèi)進行固定、通透和染色操作。
圖1 采用免疫熒光染色法對 RAW264.7
巨噬細胞M1/M2 表型標(biāo)志物進行檢測
細胞形態(tài)（輔助觀察）：M1細胞常變得更圓、更亮、偽足減少；M2細胞則可能變得更拉長、鋪展、類似“煎蛋”狀。但這只是輔助觀察，不能作為單一判定標(biāo)準(zhǔn)
注意：通常需要結(jié)合至少兩種方法（如qPCR+流式）來綜合判斷極化是否成功且特異。
03 成功關(guān)鍵事項
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誘導(dǎo)劑活性：細胞因子和LPS活性會隨時間下降。小量分裝，避免反復(fù)凍融，注意有效期。 -
細胞密度：60-70%匯合度是誘導(dǎo)的黃金標(biāo)準(zhǔn)。密度過高細胞易衰老，過低則反應(yīng)不足。 -
設(shè)置對照：未處理組和溶劑對照組可幫你排除基礎(chǔ)表達和溶劑效應(yīng)。 -
操作輕柔：換液、洗滌時動作要輕，避免把貼壁不牢的細胞沖掉。 -
時間一致性：確保所有處理組在同一時間點收獲細胞，減少時間變量帶來的誤差。
近岸蛋白可提供科研級IFN gamma，IL-4，IL-10，IL-13等細胞因子產(chǎn)品，高活性，低內(nèi)毒素，助力體外巨噬細胞培養(yǎng)。
RAW264.7來源巨噬細胞培養(yǎng)因子
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目錄號 |
產(chǎn)品名稱 |
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C746（引用文獻50+） |
Recombinant Mouse IFN gamma |
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CK15（引用文獻70+） |
Recombinant Mouse IL-4 |
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C697（引用文獻5+） |
Recombinant Mouse IL-10 |
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CH18（引用文獻5+） |
Recombinant Mouse IL-13 |
Recombinant Mouse IFN gamma （Cat#C746）
Determined by its ability to inhibit the proliferation of murine WEHI-279 cells. The expected ED50 is 1 ng/ml.
Recombinant Mouse IL-4 (Cat#CK15)
Measured in a cell proliferation assay using NFS60 mouse myelogenous leukemia lymphoblast cells.The ED50 for this effect is 182 pg/mL.
參考文獻
[1]Kimbrough D, Wang SH, Wright LH, et al. HDAC inhibition helps post-MI healing by modulating macrophage polarization. J Mol Cell Cardiol. 2018;119:51-63. doi:10.1016/j.yjmcc.2018.04.011
[2]Li P, Hao Z, Wu J, et al. Comparative Proteomic Analysis of Polarized Human THP-1 and Mouse RAW264.7 Macrophages. Front Immunol. 2021;12:700009. Published 2021 Jun 29. doi:10.3389/fimmu.2021.700009