實驗原理

cDNA文庫是指生物某發育時期或不同組織的細胞所轉錄的全部mRNA經反轉錄形成的cDN**段，將該片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。典cDNA文庫構建的基本原理是已Oligo(dT)作逆轉錄引物,或者用隨機引物,擴增出第一條cDNA鏈，以第一條cDNA為模板，擴增出反義鏈，然后給所合成的cDNA加上適當的連接接頭,連接到適當的載體中獲得文庫。cDNA文庫常用于：

（1）用于分離全長基因進而開展基因功能研究；
（2）篩選目的基因并直接用于表達；
（3）提供構建分子標記連鎖圖譜的所用探針。
其基本步驟包括：（1）mRNA的獲得。（2）cDNA第一條鏈的合成。（3）cDNA第二條鏈的合成。（4）雙鏈cDNA的修飾。（5）雙鏈cDNA的分子克隆。

實驗材料

mRNA模板，DTT，蒸餾水，dNTP，EDTA，SDS，乙醇，聚合酶，瓊脂糖，DNA聚合酶，T4 DNA連接酶等

離心機，PCR儀，電泳儀，制冰機，移液器等

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實驗過程

一、反轉錄酶催化cDNA第一鏈

1、按照下面的表格配制反轉錄體系

表格中的各成分須在冰上預冷，并在冰上進行配制

2、反應體系配制成功以后，吸取2.5ul轉移到新的EP管中，并加入0.1ul[α-32P]dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。將配制好的反應體系放入PCR儀中，37℃孵育1h。

3、孵育結束后，立即向小反應管中加入1ul 0.25mmol/L EDTA，然后將反應管轉移到冰上，大反應管則70℃孵育10min后轉移到冰上。

4、測定小反應管中的總活度和可被TCA沉淀的放射性活度。按照下面的公式計算cDNA第一鏈的合成量。

[摻入的活度值(cpm)/總活度值]×66(μg)=合成的 cDNA 第一鏈(μg)

二、cDNA第二鏈的合成

1、將下表中的成分依次加入步驟一的大規模反應管中

輕柔震蕩以后，放入PCR儀中，16℃孵育2-4h。

2、孵育結束后，加入下表中的成分，室溫孵育15min。

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3、然后向反應體系中加入1ul dNTP，2ul T4噬菌體DNA聚合酶，混合均勻后室溫下孵育15min。

4、取出3ul測定第二鏈合成產物中可被TCA沉淀的放射性活度，然后計算cDNA第二鏈的合成量。
[第二鏈反應中所摻入的活度值(cpm)/總活度值(cpm)]*(66μg -xμg)=cDNA 第二鏈合成量/μg

5、向上訴反應體系中加入5ul 0.5mol/L EDTA(pH8.0)終止反應，然后用酚氯仿進行抽提，在0.3mol/L（pH5.2）乙酸鈉的存在下，用預冷的無水乙醇沉淀DNA，后用90ulTE溶解。

6、向DNA溶液中加入10ul 10X T4多核苷酸激酶緩沖液和1ul的T4多核苷酸激酶，室溫下孵育15min進行磷酸化。

7、用等體積的酚氯仿對磷酸化后的cDNA進行抽提純化。

8、用Sephadex G-50進行柱層析把cDNA和為摻入的dNTP分開

9、加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積預冷的無水乙醇，沉淀經柱層析洗脫下來的cDNA，冰上冰浴15-30min后，在冷凍離心機中已大轉速離心15min，沉淀DNA。用預冷的70%乙醇再次洗滌DNA沉淀，室溫晾干后加入80ulTE溶解。

三、連接接頭

1、cDNA樣品在68℃中加熱5min，然后將cDNA樣品冷卻至37℃，加入10ul 5X T4噬菌體DNA聚合酶修復緩沖液和5uldNTP溶液，后加水補至50ul。37℃孵育15min。

2、加入1ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0）終止反應。然后用酚氯仿進行抽提。

3、用Sephadex G-50進行柱層析把cDNA和為摻入的dNTP分開。

4、加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積預冷的無水乙醇，沉淀經柱層析洗脫下來的cDNA，冰上冰浴15-30min后，在冷凍離心機中已大轉速離心15min，沉淀DNA。用預冷的70%乙醇再次洗滌DNA沉淀，室溫晾干后加入13μl的10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶解。

5、將下列成分加入到已削成平末端的DNA中

混勻后，16℃孵育12h

5、取反應液中0.5ul放入4℃冰箱中備用，其余反應液于68℃加熱15min已終止連接反應。

6、Sepharose CL-4B 凝膠過濾法分離 cDNA
1） 把一層薄棉推進 1ml 滅菌吸管端部，用無菌剪刀剪去露在吸管外的棉花，用濾過的壓縮空氣將余下的棉拭子吹至吸管狹窄端。
2） 將一段無菌的聚氯乙烯軟管與吸管窄端相連，將吸管寬端浸于含有0.1 mol/L NaCl 的TE（pH7.6）溶液中。將聚氯乙烯管不與連于真空裝置的錐瓶相接。輕緩抽吸，直至吸管內充滿緩沖液，用止血鉗關閉軟管。
3） 在吸管寬端接一段乙烯泡沫管，讓糊狀物靜置數分鐘，放開止血鉗，當緩沖液從吸管滴落時，即形成層析柱。
4） 將3-5倍柱床體積的含 0.1 mol/L 氯化鈉的 TE(pH7.6)洗滌柱子。
5） 用巴斯德吸管吸去柱中 Sepharose CL-4B 上層的液體，將 cDNA 加到柱上，放開止血鉗，使 cDNA 進入凝膠。然后用 50μl TE(pH7.6)洗滌盛裝 cDNA 的EP管，將洗液亦加于柱上。用含 0.1 mol/L NaCl 的 TE(pH7.6)充滿泡沫管。
6） 監測 cDNA 流經柱子的進程。放射性 cDNA 流到柱長2/3位置時，開始用EP管收集，每2滴收集一管，直至將所有放射性洗脫出柱為止。
7） 用切侖科夫計數器測量每管的放射性活性。
8） 從每一管中取出一小份，以末端標記的已知大小（0.2kb-5kb）的 DNA 片斷作標準參照物，通過 1%瓊脂凝膠電泳進行分析，將各管余下部分貯存于-20℃，直至獲得瓊脂糖凝膠電泳的放射自顯影片。
9） 電泳后將凝膠移至濾紙上，蓋上一張 Saran 包裝膜，并在凝膠干燥器上干燥。干燥過程前 20min 至 30min 于 50℃加熱，然后停止加熱，在真空狀態繼續干燥1-2h。
10） 置-70℃加增感屏對干燥的凝膠繼續 X 射線曝光。
11）在cDNA的收集管中，加入 0.1 倍體積的 3mol/L 乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積預冷的乙醇。于4℃放置至少15min使cDNA沉淀，用冷凍離心機于4℃以大轉速離心 15min，以回收沉淀的 cDNA。
12） 將 DNA 溶于總體積為 20μl 的 10 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)中。
13） 測定每一小份放射性活度。算出選定的組分中所得到的總放射性活度值。計算可用于連接的 DNA 總量。
[選定組分的總活度值(cpm)/摻入到第二鏈的活度值(cpm)]*2xμg cDNA 第二鏈合成量=可用于連接的 cDNA

四、連接

根據實驗需要將獲得的cDNA連接到所需要的載體上，此處對連接過程不再多做描述。

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